FBXO31介導(dǎo)的OGT泛素化維持O-GlcNAcylation穩(wěn)態(tài)以抑制子宮內(nèi)膜惡性腫瘤

         蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化是一種與細(xì)胞代謝可塑性密切相關(guān)的翻譯后修飾。在包括子宮內(nèi)膜癌（EC）在內(nèi)的多種癌癥中均觀察到異常的O-GlcNAc糖基化現(xiàn)象。然而，關(guān)于EC中O-GlcNAc糖基化穩(wěn)態(tài)失調(diào)的臨床特征及其分子機(jī)制研究仍不完善。本研究通過(guò)包含219例腫瘤組織的中國(guó)患者隊(duì)列分析發(fā)現(xiàn)，O-GlcNAc糖基化水平與EC組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)，該結(jié)果在癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)集中得到驗(yàn)證。在患者來(lái)源的子宮內(nèi)膜上皮類(lèi)器官中，提高O-GlcNAc糖基化水平可促進(jìn)增殖和干細(xì)胞樣特性，而降低O-GlcNAc糖基化則會(huì)抑制子宮內(nèi)膜癌類(lèi)器官的生長(zhǎng)。CRISPR篩選和生化分析表明，腫瘤抑制因子FBXO31通過(guò)泛素化修飾O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶OGT來(lái)調(diào)控EC中的O-GlcNAc糖基化穩(wěn)態(tài)。下調(diào)O-GlcNAc糖基化可有效抑制小鼠模型中EC腫瘤的形成。本研究系統(tǒng)論證了O-GlcNAc糖基化可作為晚期低分化EC病例的分層標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。該研究于2025年2月發(fā)表在《Nature Communications》，IF：14.7。

技術(shù)路線(xiàn)：

主要研究結(jié)果：

1.子宮內(nèi)膜癌中O-GlcNAc糖基化水平升高與組織學(xué)分級(jí)及不良預(yù)后呈正相關(guān)

         為探究EC組織中O-GlcNAc糖基化的整體水平，我們采用上海芯超生物科技有限公司提供的EC組織芯片（包含23例癌旁和31例癌變子宮內(nèi)膜標(biāo)本），使用抗O-GlcNAc單克隆抗體RL2（該抗體以大鼠肝細(xì)胞核孔復(fù)合體-核纖層組分為免疫原制備，已通過(guò)多種應(yīng)用場(chǎng)景驗(yàn)證其跨物種檢測(cè)O-GlcNAc糖基化的廣泛適用性24,27–34）以及OGT、OGA抗體進(jìn)行免疫組化分析（圖1a）。結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，EC組織上皮細(xì)胞中O-GlcNAc糖基化水平和OGT表達(dá)量均顯著升高（圖1b-e），這與既往研究結(jié)論一致24。然而，OGA在癌旁與癌變子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)未見(jiàn)顯著差異。

         為深入探究O-GlcNAc糖基化水平與子宮內(nèi)膜癌臨床特征的關(guān)系，我們將研究隊(duì)列擴(kuò)展至中南大學(xué)湘雅醫(yī)院婦科接受子宮切除術(shù)的219例EC患者（圖1a）。對(duì)石蠟包埋的EC組織切片進(jìn)行免疫組化分析，通過(guò)RL2抗體染色半定量評(píng)估各樣本O-GlcNAc糖基化水平并進(jìn)行患者分組。具體而言，由兩名獨(dú)立評(píng)估人員根據(jù)陽(yáng)性染色腫瘤細(xì)胞比例（評(píng)分0-4分：0=陰性；1=1-25%；2=26-50%；3=51-75%；4=76-100%）和染色強(qiáng)度（評(píng)分0-3分：0=陰性；1=弱；2=中等；3=強(qiáng)）進(jìn)行量化評(píng)分，并經(jīng)病理學(xué)家復(fù)核確認(rèn)。最終以比例評(píng)分與強(qiáng)度評(píng)分的乘積作為各樣本的免疫組化總分35-37。根據(jù)IHC評(píng)分將患者分為高O-GlcNAc糖基化組（High-RL2：8-12分）和低O-GlcNAc糖基化組（Low-RL2：0-6分）。這種高低分組狀態(tài)與EC組織學(xué)分級(jí)、FIGO分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（附表1）。值得注意的是，組織學(xué)分級(jí)更高的EC患者組織中O-GlcNAc糖基化水平顯著升高（圖1f），且G3級(jí)患者中高O-GlcNAc糖基化病例明顯富集（圖1g）。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析顯示，O-GlcNAc糖基化水平與腫瘤組織學(xué)分級(jí)（Goodman-Kruskal gamma統(tǒng)計(jì)量p≤0.0001；雙側(cè)gamma-knife γ=0.473）及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（Goodman-Kruskal gamma統(tǒng)計(jì)量p=0.003；雙側(cè)gamma-knife γ=1）均呈正相關(guān)。Kaplan-Meier分析表明，高O-GlcNAc糖基化組患者的無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS）均顯著短于低O-GlcNAc糖基化組（圖1h,i）。單因素分析顯示O-GlcNAc糖基化水平與年齡、FIGO分期、肌層浸潤(rùn)深度均為PFS的顯著相關(guān)因素。后續(xù)對(duì)所有顯著性變量（p<0.05）進(jìn)行多因素Cox回歸分析，最終確定O-GlcNAc糖基化水平與年齡是EC患者臨床結(jié)局的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子（附表2）。

圖1.子宮內(nèi)膜癌中O-GlcNAc糖基化水平升高與組織學(xué)分級(jí)及不良預(yù)后呈正相關(guān)

2.基于TCGA子宮內(nèi)膜癌數(shù)據(jù)集計(jì)算的虛擬O-GlcNAc指數(shù)與腫瘤組織學(xué)分級(jí)及生存期相關(guān)

         為驗(yàn)證本研究中發(fā)現(xiàn)的關(guān)聯(lián)性，我們利用TCGA UCEC數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證分析。僅基于OGT或OGA表達(dá)的總體生存期（OS）Kaplan-Meier分析未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示單純OGT或OGA的mRNA豐度不足以反映O-GlcNAc糖基化水平，EC中OGT蛋白量可能受翻譯或翻譯后調(diào)控。為更準(zhǔn)確評(píng)估O-GlcNAc糖基化水平，我們根據(jù)RL2免疫組化評(píng)分選取40例高O-GlcNAc糖基化和15例低O-GlcNAc糖基化冷凍EC樣本進(jìn)行RNA測(cè)序?；蚣患治觯?span>GSEA）顯示，高O-GlcNAc糖基化組中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和血管生成相關(guān)基因顯著富集。進(jìn)一步計(jì)算各基因轉(zhuǎn)錄水平與O-GlcNAc糖基化免疫組化評(píng)分的Pearson相關(guān)系數(shù)（r），篩選r>0.3的前1000個(gè)基因構(gòu)成O-GlcNAc糖基化相關(guān)基因集?；虮倔w（GO）分析表明這些基因在纖毛相關(guān)生物過(guò)程中高度富集，該結(jié)果與O-GlcNAc糖基化水平與EC組織學(xué)分級(jí)的關(guān)聯(lián)性一致，因?yàn)槎嗬w毛形成是子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分化的標(biāo)志。

         我們隨后基于該基因集表達(dá)矩陣，采用R語(yǔ)言機(jī)器學(xué)習(xí)算法構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，計(jì)算TCGA UCEC隊(duì)列中每個(gè)樣本的虛擬O-GlcNAc指數(shù)。TCGA數(shù)據(jù)集中計(jì)算的O-GlcNAc指數(shù)與組織學(xué)分級(jí)和FIGO分期顯著相關(guān)（圖2a），這鞏固了本EC隊(duì)列的觀察結(jié)果。晚期G3級(jí)患者組的O-GlcNAc指數(shù)顯著高于G1或G2級(jí)組（圖2b）；同樣，FIGO II-IV期患者的指數(shù)也較I期患者顯著升高（圖2c）。值得注意的是，分析O-GlcNAc指數(shù)與EC分子分型的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在所有EC病例中臨床預(yù)后最差的拷貝數(shù)高型患者39，其O-GlcNAc指數(shù)顯著高于其他分子亞型（圖2d）。該指數(shù)還隨年齡增長(zhǎng)而升高，而年齡是EC患者臨床結(jié)局的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子（圖2e）。我們進(jìn)一步以O-GlcNAc指數(shù)中位值為界，將TCGA隊(duì)列中的EC患者分為高/低O-GlcNAc糖基化組，高O-GlcNAc糖基化組患者的無(wú)進(jìn)展間期（PFI）和總生存期（OS）均顯著縮短（圖2f,g）。綜上所述，無(wú)論是在本研究的EC患者隊(duì)列還是TCGA UCEC數(shù)據(jù)集中，子宮內(nèi)膜癌組織中升高的O-GlcNAc糖基化水平均與更晚期的組織學(xué)分級(jí)及更差的臨床預(yù)后顯著相關(guān)。

圖2.基于TCGA子宮內(nèi)膜癌數(shù)據(jù)集計(jì)算的虛擬O-GlcNAc指數(shù)與腫瘤組織學(xué)分級(jí)及生存期相關(guān)

3.抑制OGA升高O-GlcNAc糖基化促進(jìn)非癌性子宮內(nèi)膜上皮類(lèi)器官增殖與干性

         已有小分子抑制劑可調(diào)控O-GlcNAc循環(huán)酶OGT和OGA活性，被廣泛用于體外和體內(nèi)研究O-GlcNAc糖基化功能42-52。我們使用OGA抑制劑Thiamet-G（TMG）處理EE-Os以提升細(xì)胞O-GlcNAc糖基化水平（圖3a,b）。TMG處理增強(qiáng)了EE-Os的集落形成能力和類(lèi)器官生長(zhǎng)（圖3c,d），并增加每個(gè)EE-O中有絲分裂細(xì)胞數(shù)量（圖3e,f）。乙?；?span>α-微管蛋白（Ac-tubulin）和PAEP分別是子宮內(nèi)膜多纖毛上皮細(xì)胞和分泌細(xì)胞的分化標(biāo)志物41。TMG處理導(dǎo)致PAEP陽(yáng)性細(xì)胞和Ac-tubulin標(biāo)記的多纖毛細(xì)胞數(shù)量減少（圖3g,h），提示O-GlcNAc糖基化水平升高引起EE-Os中子宮內(nèi)膜細(xì)胞去分化。我們進(jìn)一步檢測(cè)了子宮內(nèi)膜干性標(biāo)志物（SSEA-1、SOX9、ALDH1、OCT4、CD133和SOX2）表達(dá)水平。與PAEP mRNA水平下降相反，所有干性標(biāo)志物表達(dá)均上調(diào)（圖3i）。鑒于GSEA提示高O-GlcNAc糖基化可能促進(jìn)EMT和血管生成，我們還檢測(cè)了TMG處理EE-Os中這兩個(gè)過(guò)程相關(guān)基因的表達(dá)。上皮標(biāo)志物E-cadherin和ZO-1表達(dá)無(wú)變化，但6個(gè)間質(zhì)標(biāo)志物中的FN-1、Snail1、TWIST2和MMP1表達(dá)升高；血管生成相關(guān)基因中，PDGFA和VEGFC表達(dá)上調(diào)，其余基因表達(dá)未變或下調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)表明，O-GlcNAc糖基化升高可促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞去分化，并不同程度地增強(qiáng)其EMT和血管生成能力。為深入解析TMG處理對(duì)EE-Os中不同細(xì)胞亞型的影響，我們對(duì)對(duì)照組和TMG處理的EE-Os進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序分析（圖3j）。根據(jù)已知標(biāo)志物的特異性表達(dá)38,53，細(xì)胞被聚類(lèi)分為六種主要亞型：前纖毛細(xì)胞型、纖毛細(xì)胞型、干細(xì)胞型、增殖型、O-GlcNAc相關(guān)干樣細(xì)胞型和炎癥型。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)了一種O-GlcNAc相關(guān)干樣細(xì)胞亞型，該亞型細(xì)胞表現(xiàn)出激活的干細(xì)胞多能性調(diào)控信號(hào)通路及O-聚糖生物合成通路。TMG處理導(dǎo)致EE-Os中纖毛和前纖毛細(xì)胞亞型比例顯著降低，同時(shí)增殖型和O-GlcNAc相關(guān)干樣細(xì)胞亞型比例增加（圖3k），這一結(jié)果證實(shí)O-GlcNAc糖基化水平上調(diào)可促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的增殖和干性。

         作為對(duì)比，我們使用OGT抑制劑OSMI-1處理EE-Os，分析降低O-GlcNAc糖基化對(duì)非癌性子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的影響。OSMI-1處理僅輕微影響EE-Os生長(zhǎng)，且類(lèi)器官形成數(shù)量無(wú)顯著變化。TUNEL染色顯示OSMI-1處理的EE-Os未出現(xiàn)明顯凋亡，多纖毛分化細(xì)胞數(shù)量保持穩(wěn)定。對(duì)OSMI-1處理的EE-Os中干性、EMT和血管生成標(biāo)志基因的檢測(cè)也未發(fā)現(xiàn)一致性改變，這些結(jié)果表明OGT抑制對(duì)EE-Os細(xì)胞的影響較為有限。

圖3.抑制OGA升高O-GlcNAc糖基化促進(jìn)非癌性子宮內(nèi)膜上皮類(lèi)器官增殖與干性

4.抑制OGT降低O-GlcNAc糖基化可阻礙子宮內(nèi)膜癌類(lèi)器官增殖并誘導(dǎo)分化與細(xì)胞死亡

         為探究降低O-GlcNAc糖基化能否抑制EC-Os中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，我們采用OGT化學(xué)抑制劑OSMI-1處理EC-Os（圖4a,b）。OSMI-1的加入顯著阻礙了EC-Os的形成與生長(zhǎng)。與同期對(duì)照組相比，OSMI-1處理組中大量EC-Os出現(xiàn)細(xì)胞暗化裂解現(xiàn)象，導(dǎo)致類(lèi)器官數(shù)量和體積均顯著減少（圖4a-d）。TUNEL染色顯示OSMI-1處理的EC-Os中存在大量凋亡細(xì)胞（圖4e）。對(duì)形態(tài)相對(duì)正常的殘留EC-Os進(jìn)行免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)OSMI-1處理后，磷酸化組蛋白H3（PH3）標(biāo)記的有絲分裂細(xì)胞幾乎不可見(jiàn)（圖4f,g）。同時(shí)，這些EC-Os中PAEP陽(yáng)性分泌細(xì)胞和Ac-tubulin標(biāo)記的多纖毛細(xì)胞比例均增加（圖4h,i），表明OSMI-1處理促進(jìn)了細(xì)胞分化。與此一致，OSMI-1處理的EC-Os中干性標(biāo)志物（SSEA-1、SOX9、ALDH1、OCT4、CD133和SOX2）表達(dá)顯著下調(diào)，而分化標(biāo)志物PAEP表達(dá)上調(diào)（圖4j）。所有間質(zhì)標(biāo)志物（FN-1、Vimentin、Snail1、TWIST2、TGFB1和MMP1）表達(dá)均下降（圖4k），多數(shù)血管生成標(biāo)志物在OSMI-1處理的EC-Os中也呈現(xiàn)表達(dá)降低（圖4l）。

         為確認(rèn)OSMI-1對(duì)EC-Os的作用具有靶向特異性，我們通過(guò)短發(fā)夾RNA（shRNA）直接敲低OGT表達(dá)并重復(fù)實(shí)驗(yàn)。與OSMI-1處理結(jié)果一致，shRNA敲低OGT同樣能下調(diào)O-GlcNAc糖基化水平，并顯著抑制EC-Os的形成與生長(zhǎng)。OGT敲低后的EC-Os細(xì)胞凋亡增加，殘留細(xì)胞多呈現(xiàn)多纖毛化，且分化標(biāo)志物PAEP表達(dá)上調(diào)、干性基因表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果表明，不同方式誘導(dǎo)的O-GlcNAc糖基化水平降低均可導(dǎo)致EC-Os中腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受限、分化增強(qiáng)和凋亡增加。

         我們同樣采用OGA抑制劑TMG處理EC-Os以驗(yàn)證其促瘤效應(yīng)。TMG處理顯著增加EC-Os的數(shù)量和體積，干性基因（如SOX9、ALDH1、CD133和SOX2）表達(dá)上調(diào)而分化標(biāo)志物PAEP下調(diào)。此外，所有間質(zhì)標(biāo)志物及多數(shù)血管生成基因在TMG處理的EC-Os中表達(dá)均升高，提示OGA抑制可進(jìn)一步加劇惡性表型。

         子宮內(nèi)膜類(lèi)器官的OGT/OGA抑制劑實(shí)驗(yàn)顯示，EE-Os對(duì)O-GlcNAc糖基化下調(diào)的敏感性低于EC-Os。為驗(yàn)證此現(xiàn)象，我們選取2例O-GlcNAc糖基化水平較高的EC患者來(lái)源EC-Os和2例非EC患者EE-Os進(jìn)行3D細(xì)胞活力檢測(cè)。除OSMI-1外，還加入其衍生物OSMI-454。結(jié)果顯示，TMG處理促進(jìn)EE-Os和EC-Os增殖，而OSMI-1或OSMI-4抑制OGT時(shí)，EC-Os的活力降低程度顯著大于對(duì)照EE-Os（圖4m）。這些發(fā)現(xiàn)表明，OGT抑制劑能有效抑制體外腫瘤類(lèi)器官的擴(kuò)增，尤其對(duì)固有高O-GlcNAc糖基化水平的腫瘤效果顯著。

圖4.抑制OGT降低O-GlcNAc糖基化可阻礙子宮內(nèi)膜癌類(lèi)器官增殖并誘導(dǎo)分化與細(xì)胞死亡

5.全基因組篩選維持O-GlcNAc糖基化穩(wěn)態(tài)的腫瘤抑制因子

         為鑒定調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞O-GlcNAc糖基化穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因子，我們開(kāi)展了全基因組CRISPR-Cas9敲除篩選實(shí)驗(yàn)。將靶向19,050個(gè)基因（每個(gè)基因6條sgRNA）的慢病毒單導(dǎo)RNA（sgRNA）文庫(kù)與1000條非靶向?qū)φ?span>sgRNA以0.3的感染復(fù)數(shù)（MOI）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，確保每個(gè)細(xì)胞僅表達(dá)單一sgRNA。使用抗O-GlcNAc抗體RL2染色后，通過(guò)流式分選（FACS）分離RL2熒光信號(hào)最強(qiáng)的5%細(xì)胞群，并對(duì)該群體中的sgRNA進(jìn)行深度測(cè)序（圖5a、b）?；?span>sgRNA豐度數(shù)據(jù)，采用MAGeCK55計(jì)算各基因的穩(wěn)健秩和聚合（RRA）評(píng)分進(jìn)行排序，RRA評(píng)分越小表明基因重要性越高。通過(guò)文獻(xiàn)回顧我們收集了已知能影響細(xì)胞O-GlcNAc糖基化穩(wěn)態(tài)的調(diào)控因子56–71。負(fù)向調(diào)控O-GlcNAc糖基化的基因（如TSC2、SIRT1和TP53）RRA評(píng)分較小，在基因列表中較正向調(diào)控因子更集中于前半部分（圖5c）。對(duì)篩選獲得的1038個(gè)高置信度基因（p<0.05）進(jìn)行KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)這些基因顯著富集于ECM-受體相互作用、產(chǎn)熱作用、組氨酸代謝、癌癥中的蛋白聚糖以及青少年發(fā)病的成人型糖尿病等通路（圖5d）。

         為進(jìn)一步明確影響內(nèi)皮細(xì)胞（EC）組織中O-GlcNAc糖基化水平的關(guān)鍵調(diào)控因子，我們將全基因組篩選獲得的1038個(gè)陽(yáng)性候選基因與526個(gè)EC潛在抑癌基因72,73進(jìn)行交叉比對(duì)，最終鑒定出18個(gè)重疊基因（圖5e），包括ACVR1C、AGTR1、CADM2、PRKAA1、CDKN1C、CMTM3、DIRAS3、SIK1、EPHB4、GATA5、ITGAV、KLF10、MAP3K8、PLA2G2A、PTPN11、RNASEL、SPARCL1及FBXO31?；?span>TCGA UCEC數(shù)據(jù)集對(duì)上述基因進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，發(fā)現(xiàn)僅FBXO31在EC組織中表達(dá)下調(diào)且與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。為此，我們通過(guò)CRISPR技術(shù)構(gòu)建了FBXO31敲除（FBXO31-KO）的293T細(xì)胞系。RL2抗體免疫熒光染色證實(shí)，FBXO31-KO細(xì)胞中O-GlcNAc糖基化水平顯著升高（圖5f）。

圖5.全基因組篩選維持O-GlcNAc糖基化穩(wěn)態(tài)的腫瘤抑制因子

6.FBXO31通過(guò)結(jié)合并泛素化OGT限制O-GlcNAc糖基化水平

         FBXO31作為SCF泛素E3連接酶復(fù)合物的底物識(shí)別組分，可調(diào)控多種蛋白的降解（參考文獻(xiàn)74-79）。據(jù)此我們推測(cè)，FBXO31可能通過(guò)直接結(jié)合并泛素化O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶OGT來(lái)調(diào)控O-GlcNAc糖基化水平。為驗(yàn)證FBXO31與OGT的相互作用，我們首先采用細(xì)菌純化的GST-OGT蛋白與表達(dá)GFP-FBXO31的293T細(xì)胞裂解液進(jìn)行pull-down實(shí)驗(yàn)。Western blot結(jié)果顯示，相較于GST對(duì)照，GST-OGT能顯著下拉GFP-FBXO31（圖6a）。進(jìn)一步在過(guò)表達(dá)Flag-OGT和GFP-FBXO31的293T細(xì)胞中進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)GFP-FBXO31可與Flag-OGT共沉淀，且當(dāng)加入蛋白酶體抑制劑MG132后，免疫沉淀物中Flag-OGT和GFP-FBXO31的含量均顯著增加（圖6b）。

         為評(píng)估FBXO31與OGT的相互作用是否調(diào)控OGT蛋白穩(wěn)態(tài)，我們?cè)?span>293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染梯度濃度的GFP-FBXO31質(zhì)粒，通過(guò)Western blot檢測(cè)OGT及O-GlcNAc糖基化水平。結(jié)果顯示，OGT蛋白量與細(xì)胞O-GlcNAc糖基化水平均與GFP-FBXO31表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（圖6c）。值得注意的是，蛋白酶體抑制劑MG132可顯著逆轉(zhuǎn)GFP-FBXO31過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的OGT下調(diào)，表明FBXO31通過(guò)泛素-蛋白酶體降解途徑調(diào)控OGT水平（圖6d）。

         為證實(shí)FBXO31能否誘導(dǎo)OGT泛素化，我們?cè)谶^(guò)表達(dá)GFP-FBXO31和HA-泛素的293T細(xì)胞裂解液中免疫沉淀OGT，Western blot檢測(cè)到GFP-FBXO31存在時(shí)OGT呈現(xiàn)強(qiáng)烈多聚泛素化信號(hào)（圖6e）。進(jìn)一步通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：從表達(dá)HA標(biāo)記的Skp1、Cul1和Roc1（含或不含FBXO31）的293T細(xì)胞中，用HA磁珠親和純化SCF復(fù)合物，與細(xì)菌純化的E1、E2、泛素及His-OGT共孵育。結(jié)果顯示含FBXO31的SCF復(fù)合物可直接催化His-OGT發(fā)生多聚泛素化（圖6f）。鑒于SCF復(fù)合物中Skp1通過(guò)F-box結(jié)構(gòu)域招募F-box蛋白，我們構(gòu)建了FBXO31的F-box缺失突變體（FBXO31ΔF）。在293T細(xì)胞中，GFP-FBXO31與HA-泛素共表達(dá)可誘導(dǎo)免疫沉淀的Flag-OGT發(fā)生顯著多聚泛素化，而GFP-FBXO31ΔF突變體則顯著削弱該效應(yīng)（圖6g），證實(shí)FBXO31需依賴(lài)完整SCF復(fù)合物發(fā)揮E3泛素連接酶活性。

         在FBXO31-KO的293T細(xì)胞中，OGT蛋白及O-GlcNAc糖基化水平均顯著升高（圖6h）。蛋白質(zhì)合成抑制劑CHX處理實(shí)驗(yàn)顯示，FBXO31缺失使OGT半衰期明顯延長(zhǎng)（圖6i），表明FBXO31通過(guò)調(diào)控OGT降解維持其細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

         為驗(yàn)證該調(diào)控機(jī)制在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的普適性，我們?cè)?span>Ishikawa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)GFP-FBXO31。免疫熒光顯示GFP-FBXO31陽(yáng)性細(xì)胞中OGT及RL2檢測(cè)的O-GlcNAc信號(hào)均顯著降低。CRISPR構(gòu)建的FBXO31-KO Ishikawa細(xì)胞中，OGT與O-GlcNAc水平明顯上調(diào)。雖然內(nèi)源性FBXO31與OGT相互作用較弱，但外源過(guò)表達(dá)的GFP-FBXO31與Flag-OGT在Ishikawa細(xì)胞中可明確共沉淀。在過(guò)表達(dá)GFP-FBXO31和HA-泛素的Ishikawa細(xì)胞中，免疫沉淀OGT檢測(cè)到顯著的多聚泛素化信號(hào)，證實(shí)FBXO31在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中同樣通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑調(diào)控OGT。

         已知O-GlcNAc糖基化可通過(guò)穩(wěn)定YAP、β-catenin和c-Myc等蛋白促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。在野生型與FBXO31-KO Ishikawa細(xì)胞中，雖然YAP和β-catenin變化不明顯，但c-Myc水平顯著升高且該效應(yīng)依賴(lài)OGT——敲低OGT可使c-Myc恢復(fù)至野生型水平。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)c-Myc在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中存在O-GlcNAc修飾，且FBXO31缺失細(xì)胞中O-GlcNAc修飾的c-Myc顯著增加。這些結(jié)果揭示c-Myc是FBXO31-OGT調(diào)控軸下游的關(guān)鍵效應(yīng)分子，其O-GlcNAc修飾促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展。

圖6 FBXO31通過(guò)結(jié)合并泛素化OGT限制O-GlcNAc糖基化水平

7.FBXO31缺失通過(guò)增加O-GlcNAc糖基化促進(jìn)子宮內(nèi)膜類(lèi)器官生長(zhǎng)

         為探究FBXO31調(diào)控O-GlcNAc糖基化穩(wěn)態(tài)的臨床意義，我們利用子宮內(nèi)膜癌隊(duì)列組織標(biāo)本進(jìn)行分析。免疫組化（IHC）顯示，相較于正常子宮內(nèi)膜組織，EC組織中FBXO31蛋白水平顯著下調(diào)，且常與O-GlcNAc糖基化水平呈負(fù)相關(guān)模式（圖7a, b）?；?span>IHC信號(hào)半定量分析發(fā)現(xiàn)，低O-GlcNAc糖基化EC組的FBXO31蛋白水平明顯高于高O-GlcNAc糖基化組（圖7c）。進(jìn)一步分析TCGA UCEC隊(duì)列中虛擬O-GlcNAc指數(shù)與FBXO31表達(dá)水平的關(guān)系，觀察到顯著負(fù)相關(guān)性（圖7d）。Western blot結(jié)果顯示，與正常子宮內(nèi)膜類(lèi)器官（EE-Os）相比，EC類(lèi)器官（EC-Os）中FBXO31蛋白水平降低伴隨OGT水平升高（圖7e），提示EC組織中O-GlcNAc糖基化升高源于OGT上調(diào)。將EC隊(duì)列病例分為FBXO31低表達(dá)組與高表達(dá)組，發(fā)現(xiàn)FBXO31表達(dá)與O-GlcNAc糖基化狀態(tài)及組織學(xué)分級(jí)顯著相關(guān)（附表3）。

圖7 FBXO31缺失通過(guò)增加O-GlcNAc糖基化促進(jìn)子宮內(nèi)膜類(lèi)器官生長(zhǎng)

8.OGT化學(xué)抑制抑制小鼠模型子宮內(nèi)膜腫瘤生長(zhǎng)

         體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)O-GlcNAc糖基化對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的影響后，我們推測(cè)靶向OGT降低O-GlcNAc水平可能成為潛在治療策略。為此，我們?cè)?span>Ishikawa細(xì)胞異種移植小鼠模型中評(píng)估了OGT抑制劑OSMI-1的抗腫瘤效果。皮下移植Ishikawa細(xì)胞10天后，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為三組，分別通過(guò)腹腔注射給予DMSO（溶劑對(duì)照）、TMG（20 mg/kg/天）或OSMI-1（10 mg/kg/天）（圖8a）。與對(duì)照組相比，TMG處理促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)并縮短生存期，而OSMI-1處理顯著減小腫瘤體積并延長(zhǎng)生存時(shí)間（圖8b, c）。對(duì)切除腫瘤組織的免疫組化分析顯示，OSMI-1組O-GlcNAc糖基化水平較TMG組或DMSO對(duì)照組明顯降低（圖8d）。一致性分析表明，OSMI-1處理后腫瘤組織中分化標(biāo)志物PAEP表達(dá)升高，同時(shí)多種干性基因表達(dá)輕度下調(diào)；而TMG處理則導(dǎo)致PAEP表達(dá)下降與干性標(biāo)志物上調(diào)。

         為探究FBXO31缺失是否促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌（EC）小鼠模型中的腫瘤形成并增強(qiáng)對(duì)OSMI-1治療的敏感性，我們將野生型（WT）與FBXO31敲除（FBXO31-KO）的Ishikawa細(xì)胞皮下接種于裸鼠。移植10天后，將荷瘤小鼠隨機(jī)分組，通過(guò)腹腔注射給予DMSO（溶劑對(duì)照）或OSMI-1（10 mg/kg/天）（圖8e）。FBXO31-KO細(xì)胞形成的腫瘤生長(zhǎng)速度顯著快于WT組（圖8f），且干性基因（SOX9、ALDH、OCT4、CD133和SOX2）表達(dá)上調(diào)。OSMI-1處理可降低兩組腫瘤組織的O-GlcNAc糖基化水平，抑制干性基因表達(dá)，并顯著延緩WT與FBXO31-KO組的腫瘤生長(zhǎng)（圖8f）。值得注意的是，FBXO31-KO腫瘤對(duì)OSMI-1治療的敏感性較WT組更高（圖8f, g）。此外，CD31免疫熒光染色顯示FBXO31-KO腫瘤具有更豐富的血管網(wǎng)絡(luò)（圖8h），而OSMI-1處理能顯著抑制其血管生成（圖8i）。

         綜上，本研究證實(shí)FBXO31缺失通過(guò)增強(qiáng)腫瘤干性和血管生成促進(jìn)EC體內(nèi)成瘤，而抑制OGT降低O-GlcNAc糖基化可有效抑制此類(lèi)腫瘤。這些發(fā)現(xiàn)表明，靶向EC中失調(diào)的O-GlcNAc糖基化穩(wěn)態(tài)是一種具有臨床轉(zhuǎn)化潛力的治療策略。

圖8 OGT化學(xué)抑制抑制小鼠模型子宮內(nèi)膜腫瘤生長(zhǎng)

5.相關(guān)機(jī)制

         本研究深入揭示了O-GlcNAc糖基化穩(wěn)態(tài)與子宮內(nèi)膜癌（EC）進(jìn)展的分子關(guān)聯(lián)，闡明了異常O-GlcNAc糖基化水平的臨床意義，并首次在子宮內(nèi)膜組織中鑒定出一個(gè)調(diào)控O-GlcNAc穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵分子模塊（圖9）。

結(jié)論：

         該研究揭示了FBXO31通過(guò)泛素化修飾O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶OGT來(lái)調(diào)控O-GlcNAcylation穩(wěn)態(tài)，并抑制子宮內(nèi)膜惡性腫瘤的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌（EC）中O-GlcNAcylation水平與組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)，且與不良預(yù)后相關(guān)。FBXO31的缺失會(huì)導(dǎo)致O-GlcNAcylation水平升高，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和干性特征。通過(guò)小鼠模型實(shí)驗(yàn)，研究還證實(shí)了靶向OGT的小分子抑制劑能夠限制EC腫瘤的形成，表明靶向O-GlcNAcylation穩(wěn)態(tài)是一種有潛力的治療策略。

         數(shù)據(jù)處理和分析、 虛擬O-GlcNAc指數(shù)計(jì)算、GSEA、RNA測(cè)序、基因表達(dá)譜分析、免疫組化、 免疫熒光分析、 Western blot、 免疫共沉淀、 體外泛素化實(shí)驗(yàn)、 CRISPR-Cas9基因編輯、 小分子抑制劑處理、單細(xì)胞RNA測(cè)序、細(xì)胞培養(yǎng)、 細(xì)胞增殖和活力檢測(cè)、 細(xì)胞凋亡檢測(cè)、 細(xì)胞分化檢測(cè)、小鼠異種移植模型、 腫瘤生長(zhǎng)和生存期觀察、 腫瘤組織分析、組織芯片制作、 H&E染色、 TUNEL測(cè)定

參考文獻(xiàn)：

         Zhang N, Meng Y, Mao S, Ni H, Huang C, Shen L, Fu K, Lv L, Yu C, Meekrathok P, Kuang C, Chen F, Zhang Y, Yuan K. FBXO31-mediated ubiquitination of OGT maintains O-GlcNAcylation homeostasis to restrain endometrial malignancy. Nat Commun. 2025 Feb 2;16(1):1274.