肥大細(xì)胞受體通過(guò)腦膜-腦軸介導(dǎo)卒中后腦部炎癥

   大腦周圍的免疫環(huán)境在監(jiān)測(cè)損傷信號(hào)方面起著基礎(chǔ)性作用。包括缺血性卒中在內(nèi)的損傷，會(huì)破壞這種平衡并引發(fā)過(guò)度的炎癥反應(yīng)，但其潛在機(jī)制尚不清楚。研究人員首次證明，肥大細(xì)胞特異性受體Mrgprb2從腦膜層面對(duì)卒中后腦部炎癥進(jìn)行調(diào)控。卒中后，Mrgprb2會(huì)引起腦膜肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放免疫介質(zhì)。這一過(guò)程首先將顱骨骨髓中的中性粒細(xì)胞募集至硬腦膜，隨后通過(guò)切割化學(xué)排斥因子信號(hào)素3a (sema3a)，進(jìn)一步促進(jìn)中性粒細(xì)胞從硬腦膜遷移至大腦內(nèi)。研究人員還發(fā)現(xiàn)，其人類同源受體MRGPRX2在人腦膜肥大細(xì)胞中表達(dá)，并在卒中后因神經(jīng)肽P物質(zhì)的上調(diào)而被激活。藥理學(xué)抑制Mrgprb2可減輕小鼠卒中后炎癥并改善神經(jīng)功能預(yù)后，這為治療提供了一個(gè)潛在的藥物靶點(diǎn)?？偠灾?，研究結(jié)果確定Mrgprb2是免疫細(xì)胞從顱骨骨髓儲(chǔ)存庫(kù)遷移至大腦的關(guān)鍵“腦膜守門員”。本文于2025年7月發(fā)布于《Cell》,IF 42.5。

圖形摘要

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1.Mrgprb2促進(jìn)缺血性卒中后損傷

   研究人員首先探究肥大細(xì)胞是否通過(guò)Mrgprb2參與缺血性卒中的病理過(guò)程。為模擬缺血性卒中，研究人員在野生型（WT）小鼠和Mrgprb2基因敲除型（Mrgprb2?/?）小鼠中實(shí)施了短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞（tMCAO）手術(shù)（圖1A）。通過(guò)激光多普勒監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在tMCAO手術(shù)期間，WT小鼠和Mrgprb2?/?小鼠的腦血流降低程度無(wú)差異，這表明卒中誘導(dǎo)效果相當(dāng)。閉塞40分鐘后撤除栓塞線，小鼠恢復(fù)48小時(shí)，隨后測(cè)量梗死腦組織體積。使用化學(xué)染色劑2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)（該染色劑能使活組織呈紅色而梗死組織不著色）進(jìn)行染色，研究人員發(fā)現(xiàn)Mrgprb2?/?小鼠的腦梗死體積顯著減?。▓D1B和1C）。MRI（磁共振成像）進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果：在48小時(shí)時(shí)，與WT小鼠相比，Mrgprb2?/?小鼠的梗死體積減少了22%±5%（圖1D和1E）。Mrgprb2?/?小鼠的中線移位程度也減輕，表明腦水腫和腦實(shí)質(zhì)損傷減輕。

圖1 Mrgprb2基因敲除小鼠免受缺血性卒中損傷

   為了明確這些可量化的梗死體積差異是否轉(zhuǎn)化為局灶性神經(jīng)功能缺損的差異，研究人員開展了多項(xiàng)行為學(xué)測(cè)試。使用28分神經(jīng)評(píng)分量表，研究人員發(fā)現(xiàn)，與Mrgprb2?/?小鼠相比，野生型（WT）小鼠早在tMCAO術(shù)后24小時(shí)就表現(xiàn)出更嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)感覺功能缺損（圖1F）。在轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中，WT小鼠的表現(xiàn)也差于Mrgprb2?/?小鼠，顯示出嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)功能障礙（圖1G）。與右側(cè)顳葉半球梗死相一致，通過(guò)CatWalk步態(tài)分析系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，WT小鼠的左前爪和左后爪趾間距（第一趾與第四趾之間的距離）減?。▓D1H），而右爪則未觀察到這種現(xiàn)象。除了神經(jīng)功能缺損較輕外，Mrgprb2?/?小鼠在tMCAO術(shù)后30天的存活率也更高（圖1I）。

2. 表達(dá)Mrgprb2的腦膜肥大細(xì)胞在卒中后被激活

   接下來(lái)，研究人員旨在明確在缺血性卒中背景下，這些表達(dá)Mrgprb2的肥大細(xì)胞的位置。為了闡明表達(dá)Mrgprb2的肥大細(xì)胞是否存在于腦膜或腦實(shí)質(zhì)中，研究人員利用了Mrgprb2-Cre；Rosa26-tdTomato(tdT)報(bào)告基因小鼠（該品系小鼠僅在表達(dá)Mrgprb2的細(xì)胞中表達(dá)tdTomato紅色熒光蛋白）。研究人員觀察到硬腦膜肥大細(xì)胞表達(dá)Mrgprb2，并且通過(guò)CD31染色可見，這些細(xì)胞緊鄰血管分布（圖2A和2B）。使用常見的肥大細(xì)胞標(biāo)記物親和素（avidin）進(jìn)行檢測(cè)，研究人員在所有硬腦膜肥大細(xì)胞中都觀察到了tdT信號(hào)，從而證實(shí)100%的硬腦膜肥大細(xì)胞均表達(dá)Mrgprb2。

圖2 Mrgprb2在腦膜肥大細(xì)胞中表達(dá)并在tMCAO后被激活

   流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)，這些tdT陽(yáng)性細(xì)胞是CD117陽(yáng)性和FcER1α陽(yáng)性的肥大細(xì)胞，并證明Mrgprb2肥大細(xì)胞僅限于硬腦膜，而不存在于腦實(shí)質(zhì)中（圖2C）。研究人員進(jìn)一步檢測(cè)了這些肥大細(xì)胞是否在卒中后遷移入腦，但在tMCAO后48小時(shí)未觀察到任何Mrgprb2肥大細(xì)胞出現(xiàn)在腦中，硬腦膜中的肥大細(xì)胞數(shù)量也無(wú)變化。這些觀察結(jié)果得到了三項(xiàng)獨(dú)立的小鼠全腦單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究（分別在基線狀態(tài)和缺血性卒中后）的佐證，所有研究均顯示腦中無(wú)Mrgprb2表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，Mrgprb2肥大細(xì)胞駐留在其固有的硬腦膜區(qū)域，并從腦膜引發(fā)病理性腦部炎癥。

   為測(cè)量這些硬腦膜肥大細(xì)胞的活性，研究人員監(jiān)測(cè)肥大細(xì)胞附近小囊泡的釋放作為脫顆粒的標(biāo)志。研究人員首先顯示，在假手術(shù)后，WT和Mrgprb2?/?小鼠的腦膜肥大細(xì)胞活化程度極低，且兩側(cè)硬腦膜的脫顆粒程度無(wú)差異。研究人員發(fā)現(xiàn)，敲除Mrgprb2能顯著降低缺血性卒中后肥大細(xì)胞的活化，因?yàn)楦采w卒中半球的硬腦膜中，WT肥大細(xì)胞在tMCAO后的脫顆粒程度顯著高于Mrgprb2?/?細(xì)胞（圖2D和2E）。研究人員還觀察到，在tMCAO后，WT腦膜中肥大細(xì)胞特異性絲氨酸蛋白酶類胰蛋白酶β2(Tpsb2)的表達(dá)量高于Mrgprb2?/?腦膜，這與WT腦膜中肥大細(xì)胞活化增強(qiáng)相一致（圖2F）。研究人員還評(píng)估了其他肥大細(xì)胞因子作為WT腦膜炎癥負(fù)荷增加的生物標(biāo)志物。盡管并非肥大細(xì)胞特異性，但分別參與單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞募集的趨化因子CCL2和CXCL2在WT小鼠腦膜中表達(dá)上調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)提示Mrgprb2在促進(jìn)tMCAO后腦膜普遍性炎癥中的作用。促炎標(biāo)志物如腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素(IL)-1β在WT小鼠tMCAO后腦膜中的表達(dá)量也呈升高趨勢(shì)。有趣的是，血管通透性標(biāo)志物血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vegf)也上調(diào)，表明Mrgprb2可能在介導(dǎo)tMCAO后血管損傷中發(fā)揮作用。綜上所述，敲除Mrgprb2導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒減少和細(xì)胞因子產(chǎn)生減少，證明Mrgprb2是缺血性卒中中腦膜肥大細(xì)胞活化的關(guān)鍵受體。

   為進(jìn)一步闡明腦膜肥大細(xì)胞活性在卒中中的作用，研究人員通過(guò)分析中性粒細(xì)胞群體研究了腦膜炎癥環(huán)境。在卒中后6小時(shí)的早期時(shí)間點(diǎn)，研究人員未觀察到腦膜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)存在差異，表明早期炎癥損傷在WT和Mrgprb2?/?小鼠之間沒(méi)有不同。然而，到16小時(shí)，與Mrgprb2?/?小鼠相比，WT小鼠腦膜中的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增加（圖2G）。值得注意的是，WT腦膜中的中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)緩慢下降，而在Mrgprb2?/?腦膜中則逐漸上升。至48小時(shí)，研究人員發(fā)現(xiàn)WT小鼠腦膜中的中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著少于Mrgprb2?/?小鼠，且這種差異持續(xù)存在超過(guò)48小時(shí)。這一發(fā)現(xiàn)表明，盡管中性粒細(xì)胞在卒中后早期被募集到WT小鼠的腦膜中，但它們會(huì)隨時(shí)間遷移出去，而不會(huì)在腦膜內(nèi)積聚。然而，在Mrgprb2?/?小鼠中，中性粒細(xì)胞緩慢浸潤(rùn)并隨時(shí)間聚集，表明它們不會(huì)像在WT小鼠中那樣顯著地遷移離開。因此研究人員推測(cè)，WT小鼠腦膜中的中性粒細(xì)胞可能轉(zhuǎn)移進(jìn)入了大腦，這可能導(dǎo)致缺血腦內(nèi)免疫環(huán)境發(fā)生改變。相應(yīng)地，研究人員接下來(lái)研究了卒中后WT和Mrgprb2?/?小鼠腦內(nèi)炎癥的結(jié)果。

3. Mrgprb2基因敲除小鼠腦內(nèi)卒中后炎癥減輕

   在評(píng)估腦部炎癥之前，研究人員首先想評(píng)估Mrgprb2肥大細(xì)胞是否介導(dǎo)了卒中的初始缺血性損傷。研究人員發(fā)現(xiàn)，在卒中后6小時(shí)，通過(guò)MRI檢測(cè)的腦梗死體積在WT和Mrgprb2?/?小鼠之間無(wú)顯著差異，表明Mrgprb2肥大細(xì)胞可能不參與急性缺血性損傷。研究人員進(jìn)一步證明，使用神經(jīng)元損傷的間接標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)以及卒中后氧化應(yīng)激標(biāo)志物4-羥基壬烯醛(4-HNE)，兩種基因型的小鼠在6小時(shí)均表現(xiàn)出相似的神經(jīng)元損傷。

   為評(píng)估缺血性卒中后的急性免疫反應(yīng)，研究人員通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量了WT和Mrgprb2?/?小鼠卒中側(cè)和對(duì)側(cè)大腦半球中的免疫細(xì)胞群體。研究人員分析了特定先天免疫細(xì)胞群體的募集情況：首先使用泛免疫細(xì)胞標(biāo)志物(CD45)和泛髓系細(xì)胞標(biāo)志物(CD11b)，然后使用細(xì)胞特異性標(biāo)志物（Ly6G標(biāo)記中性粒細(xì)胞，Ly6C標(biāo)記單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞）（圖3A）。研究人員還使用Iba1評(píng)估了總小膠質(zhì)細(xì)胞群體，并進(jìn)一步鑒定出一個(gè)CD11b陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞亞群，該亞群被一些研究證明是損傷后增加的反應(yīng)性群體。為將小膠質(zhì)細(xì)胞與中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞群體進(jìn)一步區(qū)分開，研究人員確保這些小膠質(zhì)細(xì)胞亞群均為L(zhǎng)y6G陰性和Ly6C陰性。在基線狀態(tài)下，未檢測(cè)到WT和Mrgprb2?/?小鼠腦內(nèi)免疫細(xì)胞群體存在差異。此外，在卒中后6小時(shí)的早期時(shí)間點(diǎn)也未觀察到差異，再次證明兩種基因型小鼠的即時(shí)損傷沒(méi)有不同。

圖3 Mrgprb2基因敲除小鼠在tMCAO后腦部炎癥減輕，可通過(guò)腦膜肥大細(xì)胞移植逆轉(zhuǎn)

   相反，研究人員發(fā)現(xiàn)，在tMCAO后48小時(shí)Mrgprb2?/?小鼠卒中側(cè)大腦半球的先天炎癥反應(yīng)減弱，表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、總小膠質(zhì)細(xì)胞以及CD11b陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)均減少（圖3B–3D）。這些差異在由Mrgprb2+/?小鼠繁育的WT和Mrgprb2?/?同窩仔鼠中也得到重現(xiàn)，這表明這些不同的免疫表型并非不同小鼠品系造成的假象。研究人員通過(guò)免疫熒光進(jìn)一步證明，這些免疫細(xì)胞浸潤(rùn)至卒中半球受損的GFAP陽(yáng)性組織附近，而在遠(yuǎn)離GFAP信號(hào)的對(duì)側(cè)半球則沒(méi)有積聚（圖3E）。

   與腦內(nèi)免疫細(xì)胞募集減少相一致，研究人員發(fā)現(xiàn)，與WT卒中半球相比，Mrgprb2?/?卒中半球中趨化因子CCL2和CCL3的水平顯著降低（圖3F）。研究人員還觀察到IL-6（一種與缺血性卒中不良預(yù)后相關(guān)的細(xì)胞因子）呈下降趨勢(shì)（圖3G），以及中性粒細(xì)胞特異性蛋白酶中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)顯著減少（圖3H），NE能增加血腦屏障通透性。與腦內(nèi)免疫細(xì)胞群體的變化類似，這些細(xì)胞因子和趨化因子僅在卒中后48小時(shí)表現(xiàn)出顯著差異，而在6小時(shí)的早期損傷階段則無(wú)差異。

   鑒于已知肥大細(xì)胞在其他炎癥損傷中會(huì)募集中性粒細(xì)胞，研究人員選擇聚焦于中性粒細(xì)胞在卒中中的調(diào)控。研究人員之前顯示，CXCL2（一種由肥大細(xì)胞釋放的中性粒細(xì)胞募集主要調(diào)控因子）在WT小鼠tMCAO后腦膜中表達(dá)上調(diào)（圖2F）。相應(yīng)地，研究人員證明，通過(guò)小腦延髓池注射中和抗體以阻斷CXCL2，可減弱WT小鼠（而非Mrgprb2?/?小鼠）卒中后中性粒細(xì)胞特異性向腦內(nèi)的募集。在注射對(duì)照載體的小鼠中未觀察到這種減少，表明Mrgprb2可能通過(guò)CXCL2化學(xué)趨化中性粒細(xì)胞。研究人員還發(fā)現(xiàn)，WT小鼠腦內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少的同時(shí)，伴有梗死體積減小和功能預(yù)后改善，這便將腦內(nèi)中性粒細(xì)胞特異性募集與卒中預(yù)后惡化聯(lián)系起來(lái)。

   由于Mrgprb2也在腦膜以外的結(jié)締組織肥大細(xì)胞（包括腹膜和皮膚）中表達(dá)，研究人員需要確保Mrgprb2介導(dǎo)腦部炎癥的作用特異性地歸因于腦膜肥大細(xì)胞。因此，研究人員將體外培養(yǎng)的WT或Mrgprb2?/?小鼠肥大細(xì)胞注射到Mrgprb2?/?小鼠的腦膜中。首先，使用Mrgprb2-tdT肥大細(xì)胞注射到非tdT的Mrgprb2?/?小鼠中，研究人員顯示，移植后tdT細(xì)胞僅在腦膜中表達(dá)（圖3I），且這些細(xì)胞未出現(xiàn)在腦或腹膜中。研究人員還觀察到腦膜肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，表明植入的細(xì)胞已在腦膜中定植（圖3J）。研究人員通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證實(shí)，這些細(xì)胞在tMCAO后不會(huì)遷移至腦或腹膜。向Mrgprb2?/?小鼠移植WT（而非Mrgprb2?/?）腦膜肥大細(xì)胞，在tMCAO后顯著增加了腦部炎癥，表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞募集增加（圖3K）。此外，移植WT（而非Mrgprb2?/?）腦膜肥大細(xì)胞增加了Mrgprb2?/?小鼠的梗死體積（圖3L）。這些數(shù)據(jù)表明，腦膜特異性的Mrgprb2肥大細(xì)胞的活性足以引發(fā)卒中后神經(jīng)炎癥。

4. Mrgprb2活性調(diào)控免疫細(xì)胞從顱骨骨髓向硬腦膜的募集

   顱骨骨髓是中樞神經(jīng)神經(jīng)免疫的重要免疫細(xì)胞儲(chǔ)存庫(kù)，在感染和損傷時(shí)為大腦特異地提供炎癥細(xì)胞來(lái)源。新研究表明，顱骨骨髓可在缺血性卒中后迅速特異性擴(kuò)增。此外，顱骨骨髓與硬腦膜通過(guò)通道相連，使得免疫細(xì)胞能夠在這兩個(gè)區(qū)域之間直接轉(zhuǎn)移。因此，研究人員推測(cè)，表達(dá)Mrgprb2的腦膜肥大細(xì)胞可能在卒中后調(diào)控顱骨骨髓免疫細(xì)胞向硬腦膜的募集。

   研究人員首先確認(rèn)，Mrgprb2的存在不改變基線狀態(tài)的顱骨骨髓免疫細(xì)胞群體。為了特異地研究顱骨骨髓募集的角色，研究人員將來(lái)自GFP報(bào)告基因小鼠(UBC-GFP)的顱骨瓣移植到WT或Mrgprb2?/?受體小鼠上，同時(shí)保持受體小鼠的硬腦膜完整（圖4A）。由于顱骨骨髓中沒(méi)有Mrgprb2肥大細(xì)胞，因此沒(méi)有將新的肥大細(xì)胞群體引入受體小鼠。研究人員還顯示，顱骨移植后10天，腦膜內(nèi)的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞群體沒(méi)有變化，表明顱骨移植本身不會(huì)破壞硬腦膜的免疫環(huán)境。GFP信號(hào)主要保留在顱骨骨髓內(nèi)，極少泄漏到血液中，這使研究人員能夠選擇性地追蹤移植小鼠中的顱骨骨髓細(xì)胞。為確保顱骨移植本身不會(huì)誘導(dǎo)顯著的顱骨骨髓細(xì)胞募集，研究人員確認(rèn)在移植后10天，不同基因型小鼠腦膜中的GFP陽(yáng)性中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞沒(méi)有顯著差異。隨后，研究人員對(duì)WT和Mrgprb2?/?受體小鼠進(jìn)行tMCAO手術(shù)，并在48小時(shí)后測(cè)量腦膜中的GFP信號(hào)。

圖4 Mrgprb2對(duì)中性粒細(xì)胞從顱骨骨髓遷移到大腦至關(guān)重要

   研究人員發(fā)現(xiàn)，在tMCAO后，Mrgprb2?/?小鼠硬腦膜中GFP陽(yáng)性中性粒細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量顯著減少（圖4B）。具體來(lái)說(shuō)，研究人員觀察到在Mrgprb2?/?小鼠的硬腦膜中，GFP陽(yáng)性中性粒細(xì)胞占腦膜中總中性粒細(xì)胞的比例降低，這表明與野生型（WT）小鼠相比，Mrgprb2?/?小鼠無(wú)法將相同比例的顱骨骨髓中性粒細(xì)胞招募到硬腦膜中（圖4C）。同樣地，研究人員在Mrgprb2?/?小鼠的硬腦膜中也觀察到GFP陽(yáng)性單核細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量減少。盡管趨勢(shì)如此，但WT和Mrgprb2?/?小鼠中GFP陽(yáng)性單核細(xì)胞進(jìn)入硬腦膜的比例并無(wú)顯著差異，這表明中性粒細(xì)胞可能是此時(shí)主要被招募的細(xì)胞。GFP陽(yáng)性中性粒細(xì)胞向硬腦膜的遷移與WT小鼠顱骨骨髓中這些細(xì)胞數(shù)量的減少相關(guān)，這與Mrgprb2?/?小鼠相比更為明顯（圖4D）。這種在顱骨骨髓中觀察到的變化在中性粒細(xì)胞群體中最為顯著，表明此時(shí)主要從中性粒細(xì)胞來(lái)源招募中性粒細(xì)胞。

   總的來(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明，硬腦膜中Mrgprb2的存在可能增強(qiáng)中性粒細(xì)胞從顱骨骨髓儲(chǔ)存庫(kù)在中風(fēng)后的招募。

5. Mrgprb2活性介導(dǎo)中性粒細(xì)胞在中風(fēng)后從硬腦膜遷移到大腦

   先前的研究表明，顱骨骨髓來(lái)源的免疫細(xì)胞可以在缺血性中風(fēng)后的急性階段浸潤(rùn)到大腦中。因此，研究人員想要評(píng)估Mrgprb2活性是否不僅能調(diào)節(jié)顱骨骨髓向硬腦膜的遷移，還能調(diào)節(jié)其進(jìn)一步浸潤(rùn)到大腦中。研究人員首先確認(rèn)了單獨(dú)的顱骨移植（無(wú)tMCAO）不會(huì)增加供體小鼠腦實(shí)質(zhì)中GFP陽(yáng)性中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞的數(shù)量。在tMCAO后，研究人員發(fā)現(xiàn)許多GFP陽(yáng)性免疫細(xì)胞和GFP陽(yáng)性中性粒細(xì)胞（圖4E）在中風(fēng)后48小時(shí)浸潤(rùn)到大腦中。研究人員進(jìn)一步證明，與Mrgprb2?/?小鼠相比，野生型（WT）小鼠在tMCAO后腦實(shí)質(zhì)中GFP陽(yáng)性中性粒細(xì)胞的數(shù)量顯著更高（圖4F）。GFP陽(yáng)性中性粒細(xì)胞與總中性粒細(xì)胞的比例在WT小鼠中也顯著更高，再次支持了這些小鼠從顱骨骨髓向腦實(shí)質(zhì)招募更大比例中性粒細(xì)胞的觀點(diǎn)（圖4G）。與腦膜類似，研究人員觀察到雖然Mrgprb2?/?小鼠大腦中GFP陽(yáng)性單核細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量顯著減少，但GFP陽(yáng)性單核細(xì)胞的比例并無(wú)顯著差異，這再次表明中性粒細(xì)胞可能是此時(shí)主要被招募的細(xì)胞。因此，研究人員確定Mrgprb2活性有助于中性粒細(xì)胞在中風(fēng)后從顱骨骨髓遷移到硬腦膜，再?gòu)挠材X膜遷移到腦實(shí)質(zhì)中。

6. Mrgprb2肥大細(xì)胞蛋白酶裂解semaphorin，即硬腦膜-大腦通道的守門員

   雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)連接顱骨骨髓和硬腦膜的通道，但最近才提出從硬腦膜到大腦的橋接靜脈存在，并通過(guò)蛛網(wǎng)膜屏障相連。這些靜脈被蛛網(wǎng)膜袖口出口點(diǎn)（ACE點(diǎn)）包圍，由semaphorin守門，這類化學(xué)排斥分子可阻止免疫細(xì)胞通過(guò)通道移動(dòng)。semaphorin表達(dá)的降低可促進(jìn)免疫細(xì)胞從硬腦膜遷移到大腦。因此，研究人員假設(shè)中風(fēng)后semaphorin的減少可能會(huì)增強(qiáng)硬腦膜中性粒細(xì)胞穿過(guò)這些橋接點(diǎn)并進(jìn)入大腦的移動(dòng)。確實(shí)，通過(guò)對(duì)腦池裂解物進(jìn)行ELISA檢測(cè)，研究人員發(fā)現(xiàn)中風(fēng)后semaphorin3a（Sema3a），而非semaphorin3d，在WT小鼠中特異性降低，但在Mrgprb2?/?小鼠中并未降低（圖4H）。

   為了確定Sema3a的減少是否是免疫細(xì)胞從硬腦膜遷移到大腦的驅(qū)動(dòng)力，研究人員假設(shè)抑制Sema3a應(yīng)該會(huì)增加中性粒細(xì)胞向大腦的遷移，并加劇中風(fēng)后的大腦炎癥。因此，在tMCAO后，研究人員通過(guò)小鼠的腦池給藥，使用已知的Sema3a抑制劑（Sema3a-I）來(lái)抑制ACE點(diǎn)界面處的Sema3a。由于Sema3a-I的IC50在0.1到0.2μM之間，研究人員在tMCAO后的6小時(shí)和24小時(shí)，以1μM的Sema3a-I對(duì)小鼠的腦池進(jìn)行處理。正如預(yù)期的那樣，Mrgprb2?/?小鼠中Sema3a的抑制降低了硬腦膜中的中性粒細(xì)胞數(shù)量，并在tMCAO后48小時(shí)增加了大腦中的中性粒細(xì)胞數(shù)量（圖4I和圖4J）。大腦炎癥的增加加劇了中風(fēng)體積（圖4K），并惡化了Mrgprb2?/?小鼠的功能結(jié)果（圖4L），這表明Sema3a的抑制足以使Mrgprb2?/?小鼠表型模擬WT小鼠。此外，Sema3a的抑制并未惡化WT小鼠中風(fēng)后的大腦炎癥，這表明在tMCAO后，WT小鼠中Sema3a已經(jīng)被抑制。綜合這些數(shù)據(jù)表明，Sema3a可能通過(guò)Mrgprb2依賴的機(jī)制被滅活。

   研究人員進(jìn)一步探討了Mrgprb2介導(dǎo)的肥大細(xì)胞活性如何滅活Sema3a。先前的研究表明，包括肥大細(xì)胞表達(dá)的一些蛋白酶（如毛霉菌素和基質(zhì)金屬蛋白酶）在內(nèi)的多種蛋白酶可以將semaphorin裂解成較小的65kDa片段。這種裂解的Sema3a失去活性，無(wú)法作為免疫細(xì)胞的化學(xué)排斥物發(fā)揮作用。研究人員在這里表明，肥大細(xì)胞裂解物（而非成纖維細(xì)胞裂解物）可以顯著將全長(zhǎng)Sema3a裂解為其失活形式（圖4M），這為Mrgprb2激活如何抑制Sema3a的化學(xué)排斥活性提供了一種潛在機(jī)制。為了確定tMCAO后WT小鼠中Sema3a的減少是否由于裂解所致，研究人員用已知的Sema3a蛋白酶對(duì)腦池組織進(jìn)行體外處理，并評(píng)估裂解的Sema3a是否能被ELISA識(shí)別。研究人員表明，Sema3a的裂解降低了其被ELISA識(shí)別的能力，這表明tMCAO后體內(nèi)Sema3a的減少可能由肥大細(xì)胞蛋白酶裂解Sema3a所解釋。綜合這些數(shù)據(jù)支持一種模型，即Mrgprb2介導(dǎo)的腦膜肥大細(xì)胞活性釋放蛋白酶，使Sema3a失活，破壞關(guān)鍵檢查點(diǎn)，從而使硬腦膜中性粒細(xì)胞通過(guò)硬腦膜-大腦通道遷移到大腦中。

6. 人類腦膜MRGPRX2肥大細(xì)胞在中風(fēng)后被激活

   接下來(lái)，研究人員探討了人類同源物MRGPRX2是否表現(xiàn)出與小鼠Mrgprb2相似的促炎活性。研究人員首先收集了非中風(fēng)患者選擇性開顱手術(shù)的硬腦膜，以確定人類硬腦膜中是否存在肥大細(xì)胞，以及它們是否表達(dá)MRGPRX2。研究人員發(fā)現(xiàn)人類硬腦膜中存在表達(dá)avidin和tryptase的肥大細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞確實(shí)表達(dá)MRGPRX2（圖5A和圖5B）。此外，研究人員還收集了中風(fēng)和非中風(fēng)患者的死后腦組織，以評(píng)估MRGPRX2肥大細(xì)胞的存在情況。雖然中風(fēng)大腦中GFAP作為損傷標(biāo)志物有所增加，但并未發(fā)現(xiàn)MRGPRX2或tryptase表達(dá)，這表明中風(fēng)后人類大腦中缺乏表達(dá)MRGPRX2的肥大細(xì)胞，與研究人員的小鼠數(shù)據(jù)一致。

圖5 人腦膜中的MRGPRX2陽(yáng)性肥大細(xì)胞在腦卒中后因SP被激活

   在確定這些細(xì)胞存在于人腦膜后，研究人員進(jìn)一步探究其是否在缺血性腦卒中患者中發(fā)揮作用。研究人員收集了因惡性大腦中動(dòng)脈綜合征而接受減壓去骨瓣手術(shù)的腦卒中患者的腦膜（圖5C和5D），發(fā)現(xiàn)腦卒中患者和對(duì)照組患者間的肥大細(xì)胞數(shù)量并無(wú)差異。但研究人員發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組患者相比，缺血性腦卒中患者的腦膜肥大細(xì)胞脫顆粒現(xiàn)象顯著更嚴(yán)重（圖5E和5G），這表明人腦膜肥大細(xì)胞在腦卒中后被激活。

7.神經(jīng)肽SP是卒中后激活Mrgprb2和MRGPRX2的配體

   在確定Mrgprb2和MRGPRX2是卒中后關(guān)鍵的肥大細(xì)胞受體后，研究人員進(jìn)一步探究其活性背后的配體。潛在候選者之一是SP，這是一款神經(jīng)肽，受傷害刺激時(shí)由神經(jīng)元釋放，也是已知的Mrgprb2/X2激動(dòng)劑。tMCAO后小鼠大腦中的SP水平上升，且先前研究表明腦卒中患者血清中SP水平較高與死亡率較高相關(guān)。

   研究人員發(fā)現(xiàn)，腦卒中后，WT和Mrgprb2?/?小鼠的梗死半球中SP水平均升高，這表明SP源自受損的神經(jīng)元組織。這種SP在腦卒中半球中的局部增加與圖2E中看到的覆蓋腦卒中半球的腦膜肥大細(xì)胞脫顆粒現(xiàn)象相吻合。為確定SP是否通過(guò)Mrgprb2介導(dǎo)炎癥，研究人員在tMCAO后向腦池內(nèi)注射SP或?qū)φ掌?。外源性SP使WT小鼠大腦中的中性粒細(xì)胞招募增加，但在Mrgprb2?/?小鼠中未見此現(xiàn)象，這表明SP通過(guò)Mrgprb2發(fā)揮作用。外源性SP還使WT小鼠的腦卒中體積增大。然而，這種腦卒中體積的增加并未使WT小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)惡化，這表明腦卒中后內(nèi)源性SP的釋放可能足以引發(fā)小鼠的強(qiáng)烈行為學(xué)反應(yīng)。而向Mrgprb2?/?小鼠注射外源性SP既未增加腦卒中體積，也未惡化行為學(xué)結(jié)局，這證實(shí)了腦卒中中的SP作用依賴于Mrgprb2。

   為深入探究SP在人腦卒中中的作用，研究人員收集血清樣本，發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中患者的血清SP水平較對(duì)照組升高（圖5H）。為明確血清SP是否激活人肥大細(xì)胞，研究人員將培養(yǎng)的人WT和MRGPRX2?/? LAD2肥大細(xì)胞暴露于健康者和腦卒中患者的血清中。研究人員發(fā)現(xiàn)，與健康者血清相比，腦卒中患者血清激活并使更多WTLAD2肥大細(xì)胞脫顆粒，而MRGPRX2?/?肥大細(xì)胞被腦卒中血清激活的數(shù)量較少。無(wú)論健康者還是腦卒中患者的血清，MRGPRX2?/?和WT肥大細(xì)胞對(duì)其反應(yīng)性相似，表明MRGPRX2特異性地感知腦卒中血清中存在的某種因子（圖5I）。為明確MRGPRX2是否對(duì)血清中的SP產(chǎn)生應(yīng)答，研究人員預(yù)先將健康者和腦卒中患者的血清與抗SP抗體共同孵育以耗盡SP。從腦卒中血清中清除SP顯著降低了其對(duì)WTLAD2肥大細(xì)胞的激活作用，但對(duì)MRGPRX2?/?LAD2肥大細(xì)胞無(wú)影響（圖5J），這表明存在特定的SP-MRGPRX2相互作用。綜上所述，研究人員的研究表明人腦膜肥大細(xì)胞在腦卒中后被激活，部分原因是SP介導(dǎo)的MRGPRX2激活。

8. Mrgprb2拮抗劑減輕腦卒中后炎癥，改善行為學(xué)缺損并降低死亡率

   研究人員進(jìn)而考慮是否可以通過(guò)藥理學(xué)抑制Mrgprb2來(lái)減輕腦卒中后炎癥并改善腦卒中結(jié)局。從防風(fēng)果實(shí)中提取的天然香豆素-歐防風(fēng)素是已知的Mrgprb2拮抗劑。研究人員確認(rèn)預(yù)先用歐防風(fēng)素處理可抑制WT小鼠培養(yǎng)肥大細(xì)胞的SP介導(dǎo)脫顆粒，但對(duì)Mrgprb2?/?小鼠無(wú)此效果（圖6A）。確認(rèn)歐防風(fēng)素是Mrgprb2拮抗劑后，研究人員在tMCAO誘導(dǎo)后6小時(shí)和24小時(shí)分別給予小鼠兩次腹腔注射，劑量為100毫克/公斤歐防風(fēng)素。在tMCAO后兩天評(píng)估WT和Mrgprb2?/?小鼠大腦的炎癥情況。結(jié)果顯示，與給予對(duì)照品的小鼠相比，給予歐防風(fēng)素的WT小鼠大腦中的中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著減少，表明炎癥減輕，而Mrgprb2?/?小鼠未見這種抗炎效果（圖6B和6C）。研究人員還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)歐防風(fēng)素處理后，WT小鼠大腦中的單核細(xì)胞減少，CD11b陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞也呈減少趨勢(shì)，但在Mrgprb2?/?小鼠中未見此現(xiàn)象。這表明歐防風(fēng)素通過(guò)Mrgprb2發(fā)揮抗炎作用。與tMCAO后48小時(shí)WT和Mrgprb2?/?小鼠腦膜炎癥差異一致，研究人員發(fā)現(xiàn)經(jīng)歐防風(fēng)素處理的WT小鼠腦膜中中性粒細(xì)胞更多，因?yàn)檫@些細(xì)胞無(wú)法進(jìn)入大腦。而經(jīng)歐防風(fēng)素處理的Mrgprb2?/?小鼠腦膜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)未見顯著差異。

圖 6 歐防風(fēng)素介導(dǎo)的Mrgprb2抑制減輕小鼠腦卒中后炎癥和神經(jīng)功能缺損

   為評(píng)估歐防風(fēng)素介導(dǎo)的腦卒中后抗炎作用是否具臨床相關(guān)性，研究人員通過(guò)核磁共振成像（MRI）測(cè)量腦卒中梗死體積。與給予對(duì)照品的野生型（WT）小鼠相比，給予歐防風(fēng)素的WT小鼠梗死體積顯著減小，中線移位也有所限制（圖6D和6E）。而Mrgprb2?/?小鼠即使給予歐防風(fēng)素，梗死體積也未進(jìn)一步減?。▓D6F）。采用28分制神經(jīng)功能評(píng)分量表發(fā)現(xiàn)，歐防風(fēng)素治療的WT小鼠（而非Mrgprb2?/?小鼠）感覺運(yùn)動(dòng)功能缺損更少（圖6G和6H）。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，tMCAO術(shù)后30天，歐防風(fēng)素治療顯著提高了WT小鼠的存活率，但在Mrgprb2?/?小鼠中未見此效果，這表明抑制Mrgprb2具有功能性療效（圖6G、6I和6J）。為進(jìn)一步證實(shí)硬腦膜中Mrgprb2在腦卒中后腦部炎癥中的作用，研究人員在tMCAO術(shù)后6小時(shí)和24小時(shí)向WT小鼠的腦池內(nèi)局部注射低劑量歐防風(fēng)素。結(jié)果顯示，局部注射歐防風(fēng)素可減輕WT小鼠的腦部炎癥，減小腦卒中體積，并改善行為學(xué)表現(xiàn)。因此，研究人員的研究表明歐防風(fēng)素通過(guò)依賴Mrgprb2的機(jī)制抑制腦卒中后炎癥并改善預(yù)后，這為抑制MRGPRX2可能成為治療人腦卒中后神經(jīng)炎癥的有前景的療法提供了證據(jù)。

   綜合上述數(shù)據(jù)，研究人員的研究支持以下模型：Mrgprb2是一個(gè)關(guān)鍵受體，使腦膜肥大細(xì)胞能夠通過(guò)神經(jīng)肽SP感知腦卒中的腦損傷。一旦被激活，這些肥大細(xì)胞就會(huì)通過(guò)釋放CXCL2等細(xì)胞因子，啟動(dòng)從顱骨骨髓招募免疫細(xì)胞的過(guò)程。Mrgprb2信號(hào)通路進(jìn)一步通過(guò)釋放蛋白酶抑制semaphorin活性，促進(jìn)這些免疫細(xì)胞通過(guò)硬腦膜-大腦通道遷移到大腦實(shí)質(zhì)中。通過(guò)這些機(jī)制，Mrgprb2信號(hào)通路在缺血性腦卒中促進(jìn)肥大細(xì)胞活性，進(jìn)而加劇腦卒中后的病理性神經(jīng)炎癥。

研究結(jié)論

   研究人員將MRGPRX2鑒定為解決腦卒中后炎癥的特異性靶點(diǎn)，通過(guò)直接抑制驅(qū)動(dòng)顱骨-硬腦膜-大腦炎癥軸的肥大細(xì)胞活性來(lái)發(fā)揮作用。MRGPRX2的表達(dá)和活性局限于血腦屏障外的腦膜，這使得大多數(shù)藥物遞送方法都能輕松到達(dá)。因此，MRGPRX2拮抗劑有望成為顯著減輕腦卒中后炎癥的潛在治療候選藥物。進(jìn)一步研究該受體在神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)中的作用，可能還會(huì)揭示其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病和紊亂中的潛在作用，凸顯肥大細(xì)胞作為腦膜中的哨兵免疫細(xì)胞，在調(diào)節(jié)腦-免疫界面的關(guān)鍵地位。

研究局限性

   本研究存在一些局限性，需進(jìn)一步探究Mrgprb2及腦膜肥大細(xì)胞在腦卒中后腦部炎癥中的作用。首先，盡管本研究旨在了解中性粒細(xì)胞向大腦的招募，但腦卒中后會(huì)招募多種免疫細(xì)胞群體。尚不清楚這群表達(dá)Mrgprb2的腦膜肥大細(xì)胞是否會(huì)影晌腦卒中后慢性炎癥狀態(tài)中T細(xì)胞和B細(xì)胞等其他細(xì)胞群體的招募。其次，研究人員提出腦膜肥大細(xì)胞對(duì)Sema3a的調(diào)控可能促進(jìn)硬腦膜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)大腦，但肥大細(xì)胞是否調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)大腦的其他機(jī)制仍有待闡明。

參考文獻(xiàn)：

Kothari et al., A mast cell receptor mediates post-stroke brain inflammation via a dural-brain axis, Cell (2025), https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.06.045.