重磅發(fā)現(xiàn)：m5C修飾的circRREB1通過誘導(dǎo)線粒體自噬促進(jìn)肺癌進(jìn)展！

   肺癌是常見的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的首要原因。環(huán)狀RNA（circRNAs）具有重要的生物學(xué)功能，并與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)。5-甲基胞嘧啶（m5C）修飾能夠調(diào)控RNA 分子的分子命運(yùn)，從而影響疾病的發(fā)展。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RREB1 在肺癌組織和細(xì)胞中高度表達(dá)，而高表達(dá)環(huán)狀RREB1 的患者預(yù)后較差。我們發(fā)現(xiàn)環(huán)狀 RREB1 通過甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2 的介導(dǎo)進(jìn)行 m5C 修飾。這種修飾通過m5C 讀取器 ALYREF 促進(jìn)其向細(xì)胞核的輸出。功能研究表明，環(huán)狀RREB1 在體外和體內(nèi)均促進(jìn)肺癌的發(fā)展。從機(jī)制上講，環(huán)狀RREB1 直接與 HSPA8 結(jié)合，并通過抑制依賴于泛素的降解來穩(wěn)定它，從而通過HSPA8/PINK1/Parkin 信號(hào)軸誘導(dǎo)線粒體自噬，并最終促進(jìn)肺癌的發(fā)展。該研究于2025年7月發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：12.8。

技術(shù)路線

Graphical Abstract

主要研究結(jié)果：

1.circRREB1在肺癌中顯著上調(diào)

   我們以人類支氣管黏膜上皮細(xì)胞作為對(duì)照組，以砷誘導(dǎo)的惡性細(xì)胞模型作為實(shí)驗(yàn)組，構(gòu)建了差異性的環(huán)狀 RNA 表達(dá)圖譜，以確定在肺癌中起關(guān)鍵作用的環(huán)狀 RNA（圖 1A）。通過對(duì)高表達(dá)的環(huán)狀RNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析以及KEGG通路富集分析，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與癌癥密切相關(guān)的環(huán)狀RNA，即circRREB1（圖 1B）。隨后，我們檢測(cè)了circRREB1 在BEAS-2B、A549、H1299、HCC827和H460細(xì)胞中的表達(dá)情況，qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，circRREB1 在這些肺癌細(xì)胞系中高度表達(dá)（圖 1C）。此外，我們還評(píng)估了circRREB1在60對(duì)肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明肺癌組織中的 circRREB1 表達(dá)顯著上調(diào)（圖 1D）。同時(shí)，深入的臨床相關(guān)性分析顯示，circRREB1 的表達(dá)與腫瘤分級(jí)和腫瘤直徑呈正相關(guān)（圖 1E、F）；ROC 分析顯示曲線下面積（AUC）為 0.859（圖 1G）?；谶@些結(jié)果，我們認(rèn)為circRREB1 有可能成為肺癌的診斷標(biāo)志物。隨后的生存分析顯示，circRREB1 高表達(dá)的患者預(yù)后比低表達(dá)的患者更差（圖 1H）。

   我們?cè)L問了 UCSC 基因?yàn)g覽器網(wǎng)站，以全面描述circRREB1 的特征，并發(fā)現(xiàn)circRREB1由位于6號(hào)染色體上的 RREB1 基因的第2至6個(gè)外顯子通過反向剪接形成，其環(huán)化位點(diǎn)通過Sanger測(cè)序得到了確認(rèn)（圖 1I）。與線性 RNA 相比，circRNA 對(duì)線性核酸酶的消化具有抵抗力。在用 RNase R 處理總 RNA 樣本后，circRREB1 比線性 GAPDH 更耐受 RNase R 的消化（圖 1J）。我們還設(shè)計(jì)了 circRREB1 特定的正向和反向引物，并使用三組樣本（RNase R - 組、RNase R + 組和 gDNA 組）進(jìn)行了 PCR 擴(kuò)增。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳和成像，由正向引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物比由反向引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物更耐受 RNase R 的消化（圖 1K）。隨后，我們用 Act D 處理細(xì)胞，提取 0 小時(shí)、4 小時(shí)、8 小時(shí)、12 小時(shí)和 24 小時(shí)的 RNA，并通過 qPCR 檢測(cè) circRREB1 和 RREB1 的表達(dá)。結(jié)果表明，circRREB1 的半衰期比 RREB1 更長(zhǎng)（圖 1L）。通過上述結(jié)果，我們確定 circRREB1 具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)。最后，通過在肺細(xì)胞系 A549 和 H1299 上進(jìn)行的熒光原位雜交（FISH）實(shí)驗(yàn)，以及在 A549 細(xì)胞中進(jìn)行的核-質(zhì)分離分析，我們研究了 circRREB1 的亞細(xì)胞定位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，circRREB1 主要位于細(xì)胞質(zhì)中。（圖 1M、N）。然而，我們使用 BEAS-2B 細(xì)胞進(jìn)行的 FISH 實(shí)驗(yàn)顯示，circRREB1 主要位于細(xì)胞核中（補(bǔ)充圖 S1A）。

圖1. circRREB1在肺癌中顯著上調(diào)

2.circRREB1的m5C修飾

   我們的初步研究發(fā)現(xiàn)，circRREB1在A549 和 BEAS-2B 細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位存在差異。鑒于異常的環(huán)狀 RNA 表達(dá)通常與腫瘤發(fā)展有關(guān)，我們旨在詳細(xì)探究環(huán)狀 RNA 表達(dá)差異的原因。m5C修飾在調(diào)節(jié)環(huán)狀RNA的命運(yùn)中起著關(guān)鍵作用。我們使用癌組織作為實(shí)驗(yàn)組，相鄰的非癌組織作為對(duì)照組，進(jìn)行了 m5C 微陣列芯片檢測(cè)，以獲得環(huán)狀 RNA 的差異 m5C 修飾圖譜。結(jié)果表明，circRREB1 可能被 m5C 修飾（圖 2A）。我們使用 m5C 修飾特異性抗體進(jìn)行了 MeRIP 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) m5C 抗體顯著富集了 circRREB1，這表明 circRREB1 中存在 m5C 修飾（圖 2B、C）。隨后，我們?cè)?50 個(gè)堿基對(duì)的片段中設(shè)計(jì)了特異性的截短引物，并進(jìn)行了 CLIP 實(shí)驗(yàn)，以探索環(huán)狀 RNA 上 m5C 修飾的位置。qPCR 結(jié)果顯示，m5C 修飾位于第二個(gè)片段（圖 2D）。

   m5C 修飾需要甲基轉(zhuǎn)移酶（writers）的參與。此前的研究表明，真核生物的 m5C 修飾通常由 NOL1/NOP2/sun（NSUN）家族和 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶成員 2（DNMT2）介導(dǎo)。我們最初進(jìn)行了 TRAP 實(shí)驗(yàn)，以確定介導(dǎo) circRREB1 的 m5C 修飾的writers。經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）和銀染處理后，我們進(jìn)行了液相色譜 - 質(zhì)譜分析（LC-MS）以確定與 circRREB1 結(jié)合的蛋白質(zhì)（圖 2E）。根據(jù) LC-MS 結(jié)果，我們確定了 NSUN2，這是一種已被報(bào)道介導(dǎo) m5C 修飾的寫入者。通過查詢 The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn) NSUN2 在肺癌組織中高度表達(dá)，且高表達(dá) NSUN2 的患者比低表達(dá) NSUN2 的患者預(yù)后更差（補(bǔ)充圖 S1B、C）。這一趨勢(shì)與肺癌組織中 circRREB1 高表達(dá)的趨勢(shì)一致。因此，我們選擇了 NSUN2 進(jìn)行進(jìn)一步研究。在 NSUN2 過表達(dá)后，我們進(jìn)行了 MeRIP 實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，circRREB1 的 m5C 修飾水平顯著升高（圖 2F、G）。

   m5C 修飾的生物學(xué)功能通常與識(shí)別蛋白有關(guān)。我們的 TRAP-MS 結(jié)果顯示，在本研究中，主要的 m5C 識(shí)別蛋白是 Aly/REF 輸出因子（ALYREF），它已被證實(shí)能夠識(shí)別 m5C 修飾并調(diào)節(jié) RNA 穩(wěn)定性和核輸出。來自 TCGA 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)表明，ALYREF 在肺癌患者中高度表達(dá)，且高 ALYREF 表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)（圖 2H，補(bǔ)充圖 S1D）。這一趨勢(shì)與肺癌組織中 circRREB1 的高表達(dá)及其主要位于細(xì)胞質(zhì)相一致。因此，ALYREF 被選作進(jìn)一步研究的對(duì)象。我們首先進(jìn)行了 RIP 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) circRREB1 直接與 ALYREF 結(jié)合（圖 2I）。隨后的 CLIP-qPCR 顯示，circRREB1 與 ALYREF 的結(jié)合區(qū)域位于第二段，這與 m5C 修飾段一致（圖 2J）。在 NSUN2 過表達(dá)的情況下，ALYREF 能夠富集更多的 circRREB1（圖 2K）。這些結(jié)果表明，ALYREF 能夠識(shí)別 circRREB1 上的 m5C 修飾。我們?cè)O(shè)計(jì)了 ALYREF siRNA 來探究 ALYREF 報(bào)道的調(diào)節(jié) RNA 分子命運(yùn)的途徑（圖 2L）。通過進(jìn)行 RNA 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn) ALYREF 基因沉默后，circRREB1 的穩(wěn)定性并未發(fā)生變化（補(bǔ)充圖 S1E）。熒光原位雜交（FISH）和核-質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)表明，ALYREF 基因沉默后，circRREB1 的核含量顯著增加（圖 2M、N）。這一發(fā)現(xiàn)表明，沉默 ALYREF 可增加 circRREB1 的核表達(dá)，這與肺癌組織中ALYREF 的高表達(dá)相一致。我們還發(fā)現(xiàn)，NSUN2 過表達(dá)顯著增加了 circRREB1 的核輸出，而 ALYREF 基因沉默則逆轉(zhuǎn)了由 NSUN2 過表達(dá)引起的核輸出增加（圖 2O）。綜上所述，這些結(jié)果表明，NSUN2 增加了 circRREB1 的 m5C 修飾水平，而 ALYREF 能夠識(shí)別 circRREB1 的 m5C 修飾，并以 m5C 依賴的方式調(diào)節(jié) circRREB1 的核輸出。

圖2. circRREB1的m5C修飾

3.circRREB1在體外顯著促進(jìn)肺癌進(jìn)展

   我們構(gòu)建了 circRREB1 基因沉默和過表達(dá)系統(tǒng)，以探究 circRREB1 的生物學(xué)功能（見補(bǔ)充圖 S2A）。EdU 檢測(cè)顯示，circRREB1 基因沉默后細(xì)胞增殖減少，而過表達(dá)后細(xì)胞增殖增加（圖 3A、B）。CCK-8 檢測(cè)顯示，circRREB1 基因沉默后細(xì)胞活力降低，而過表達(dá)后細(xì)胞活力增加（圖 3C）。細(xì)胞周期的流式細(xì)胞術(shù)分析表明，circRREB1 基因沉默后細(xì)胞周期進(jìn)程受到抑制，而過表達(dá)后細(xì)胞周期進(jìn)程加快（圖 3D、E）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，circRREB1 基因沉默后細(xì)胞凋亡增加，而過表達(dá)后細(xì)胞凋亡減少（圖 3F、G）。Transwell 和傷口愈合檢測(cè)顯示，circRREB1 基因沉默后細(xì)胞遷移減少，而過表達(dá)后細(xì)胞遷移增加（圖 3H、I；補(bǔ)充圖 S2B、C）?？傊?，circRREB1 在體外能夠顯著促進(jìn)肺癌的發(fā)展。為進(jìn)一步闡明 m5C 修飾對(duì) circRREB1 生物學(xué)功能的影響，我們同時(shí)抑制了閱讀蛋白 ALYREF 的表達(dá)，并過表達(dá)了 circRREB1，隨后評(píng)估了細(xì)胞活力和遷移能力。circRREB1 的過表達(dá)恢復(fù)了由 ALYREF 抑制所導(dǎo)致的細(xì)胞活力和遷移能力的下降（補(bǔ)充圖 S2D-F）。

圖3. circRREB1在體外顯著促進(jìn)肺癌進(jìn)展

4.circRREB1在體內(nèi)顯著促進(jìn)肺癌進(jìn)展

   我們闡明了環(huán)狀 RNA RREB1 在肺癌中的體外作用機(jī)制，隨后又探究了其在體內(nèi)的作用。首先，我們成功構(gòu)建了一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)狀 RNA RREB1 編輯沉默的 A549 細(xì)胞系（補(bǔ)充圖 S2G、H）。對(duì)照細(xì)胞和穩(wěn)定的環(huán)狀 RNA RREB1 編輯沉默細(xì)胞被皮下注射到裸鼠的右側(cè)腹側(cè)。在腫瘤形成后，每隔三天觀察一次裸鼠的存活狀況，并對(duì)每只裸鼠的體重和腫瘤體積進(jìn)行評(píng)估和記錄。在觀察期結(jié)束時(shí)，對(duì)裸鼠進(jìn)行Euthanasia，并收集腫瘤組織進(jìn)行拍照（圖 4A、B）。對(duì)腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示在環(huán)狀 RNA RREB1 編輯沉默后，腫瘤生長(zhǎng)速度變慢（圖 4C）。我們進(jìn)行了免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步闡明環(huán)狀 RNA RREB1 在體內(nèi)的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定環(huán)狀 RNA RREB1 編輯沉默的腫瘤組織中，與增殖相關(guān)的蛋白 Ki67、與細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白 cyclin D1、與凋亡相關(guān)的蛋白 BCL2 以及與遷移相關(guān)的蛋白 RhoA 的表達(dá)水平均降低（圖 4D-G）。補(bǔ)充圖 S2I-L）。總之，這些結(jié)果表明，circRREB1 在體內(nèi)能夠顯著促進(jìn)肺癌的發(fā)展。

圖4. circRREB1在體內(nèi)顯著促進(jìn)肺癌進(jìn)展

5.circRREB1通過線粒體自噬調(diào)節(jié)線粒體功能

   通過體外和體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)circRREB1能夠促進(jìn)肺癌的發(fā)展。然而，circRREB1促進(jìn)肺癌發(fā)展的具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。我們對(duì)TRAP-MS的結(jié)果進(jìn)行了KEGG通路富集分析，并確定了幾個(gè)與細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)相關(guān)的通路（圖5A）。研究表明，通過細(xì)胞色素P450酶代謝各種藥物或化學(xué)毒素所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可導(dǎo)致線粒體功能障礙。因此，我們?cè)u(píng)估了線粒體功能。通過JC-1染色，我們檢測(cè)到在circRREB1沉默后，JC-1聚集體的水平（以紅色熒光表示）降低，而JC-1單體的水平（以綠色熒光表示）升高，這表明線粒體膜電位降低。相比之下，circRREB1的過表達(dá)導(dǎo)致JC-1聚集體水平升高，JC-1單體水平降低，表明線粒體膜電位升高（圖5B）。此外，在進(jìn)行 TMRE 染色后還進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，以檢測(cè)線粒體膜電位。這些結(jié)果與 JC-1 染色的結(jié)果一致，JC-1 染色顯示，沉默 circRREB1 會(huì)降低線粒體膜電位，而過表達(dá) circRREB1 則會(huì)增加線粒體膜電位（圖 5C、D）。我們還測(cè)量了細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS）水平，發(fā)現(xiàn)沉默 circRREB1 后 ROS 水平升高，而過表達(dá) circRREB1 后 ROS 水平降低，這表明在沉默 circRREB1 后線粒體功能受損，在過表達(dá) circRREB1 后線粒體功能增強(qiáng)（圖 5E、F）。

   線粒體自噬是通過特定方式專門針對(duì)受損線粒體進(jìn)行的自噬過程，是調(diào)節(jié)線粒體功能的關(guān)鍵途徑。我們使用 MitoTracker Green 和 LysoTracker Red 分別對(duì)線粒體和溶酶體進(jìn)行標(biāo)記，并觀察線粒體與溶酶體的共定位情況，以探究 circRREB1 是否能調(diào)節(jié)線粒體自噬。我們發(fā)現(xiàn)，沉默 circRREB1 顯著降低了線粒體與溶酶體的共定位，而過表達(dá) circRREB1 則顯著增加了這種共定位，這表明 circRREB1 能夠正向調(diào)節(jié)線粒體自噬（圖 5G、H）。PINK1/Parkin 途徑是線粒體自噬的經(jīng)典途徑。我們進(jìn)行了 WB 檢測(cè)與 PINK1 介導(dǎo)的線粒體自噬相關(guān)的蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示，沉默 circRREB1 降低了 PINK1、Parkin 和 LC3 的表達(dá)，并增加了線粒體外膜蛋白 TOM20 的表達(dá)。相比之下，過表達(dá) circRREB1 增加了 PINK1、Parkin 和 LC3 的表達(dá)，并降低了 TOM20 的表達(dá)，這表明 circRREB1 能夠在細(xì)胞水平上調(diào)節(jié)線粒體自噬（圖 5I、補(bǔ)充圖 S3A-D）。我們通過在異種移植組織上進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，以評(píng)估 PINK1 和 Parkin 的水平，來探究 circRREB1 是否在體內(nèi)促進(jìn)線粒體自噬。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制 circRREB1 的表達(dá)會(huì)降低其水平（圖 5J-L）。隨后，我們從裸鼠的腫瘤組織中提取蛋白質(zhì)，并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)與線粒體自噬相關(guān)的蛋白質(zhì)。與免疫組織化學(xué)結(jié)果一致的是，穩(wěn)定抑制 circRREB1 顯著降低與線粒體自噬相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)（補(bǔ)充圖 S3E）。當(dāng)同時(shí)抑制 m5C 讀取器 ALYREF 并過表達(dá) circRREB1 時(shí)，線粒體與溶酶體的共定位顯示，m5C 修飾也調(diào)節(jié)了由 circRREB1 過表達(dá)引起的共定位增加（補(bǔ)充圖 S3F、G）。當(dāng)過表達(dá) circRREB1 后，用自噬抑制劑氯喹（CQ）處理細(xì)胞，并檢測(cè)活性氧（ROS）水平時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)氯喹的加入抑制了自噬，導(dǎo)致 ROS 水平升高，表明受損線粒體的數(shù)量增加了（圖 5M、N）。這些結(jié)果表明，circRREB1 通過線粒體自噬增強(qiáng)線粒體功能。我們添加了氯喹以抑制線粒體自噬，并檢測(cè)了細(xì)胞凋亡的水平，以探究環(huán)狀 RREB1 是否通過線粒體自噬來調(diào)控肺癌的發(fā)展，并發(fā)現(xiàn)添加氯喹能夠逆轉(zhuǎn)由環(huán)狀 RREB1 過表達(dá)所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡減少現(xiàn)象（補(bǔ)充圖 S3H、I）?？傊?，環(huán)狀RREB1 可能通過 PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬來調(diào)節(jié)線粒體功能，從而促進(jìn)肺癌的發(fā)展。

圖5.circRREB1通過線粒體自噬調(diào)節(jié)線粒體功能

6.circRREB1與HSPA8蛋白結(jié)合，抑制其泛素化和降解

   circRREB1 能夠調(diào)節(jié) PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬過程，然而針對(duì) circRREB1 的 TRAP-MS 結(jié)果并未包含 PINK1 蛋白，且沉默和過表達(dá) circRREB1 并未顯著改變 PINK1 的 mRNA 水平（補(bǔ)充圖 S4A）。我們推測(cè)，circRREB1 可能通過中間蛋白在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控 PINK1 的表達(dá)。因此，我們將與通過 TRAP-MS 識(shí)別的蛋白質(zhì)相關(guān)的自噬相關(guān)基因進(jìn)行交叉分析，創(chuàng)建了一個(gè)維恩圖，并選擇了 HSPA8 蛋白（圖 6A）。在沉默和過表達(dá) circRREB1 后，HSPA8 mRNA 的水平未發(fā)生變化（補(bǔ)充圖 S4B）。因此，我們推測(cè) circRREB1 可能直接與 HSPA8 蛋白相互作用，從而影響其表達(dá)。我們進(jìn)行了 FISH 和 IF 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) circRREB1 和 HSPA8 共定位（圖 6B）。與 IgG 相比，在 RIP 實(shí)驗(yàn)中，HSPA8 對(duì) circRREB1 的結(jié)合更多（圖 6C、D）。這些結(jié)果表明 circRREB1 直接與 HSPA8 結(jié)合。為確定 circRREB1 和 HSPA8 之間的結(jié)合區(qū)域，我們進(jìn)行了 CLIP 實(shí)驗(yàn)。通過 CLIP 實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn) HSPA8 與 circRREB1 的第 13 區(qū)域結(jié)合（圖 6E）。隨后，我們利用 RBPMap預(yù)測(cè)了環(huán)狀 RREB1 第 13 節(jié)段中的潛在蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)了針對(duì)這些結(jié)合區(qū)域的節(jié)段特異性引物以及相應(yīng)的突變引物。CLIP 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了環(huán)狀 RREB1 與 HSPA8 之間存在特定的結(jié)合模式（圖 6F、G）。

   隨后，我們進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)以檢測(cè) HSPA8 蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn) circRREB1 能夠正向調(diào)節(jié) HSPA8 蛋白的表達(dá)（圖 6H，補(bǔ)充圖 S4C）。對(duì)來自裸鼠腫瘤組織提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡分析顯示，在穩(wěn)定沉默 circRREB1 的組中，HSPA8 的表達(dá)有所降低（圖 6I）。通過免疫組織化學(xué)法，我們發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定沉默 circRREB1 后，其表達(dá)水平顯著降低（圖 6J，補(bǔ)充圖 S4D）。通過查詢 TCGA 數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)肺癌患者中 HSPA8 的表達(dá)增加，且 HSPA8 高表達(dá)組的生存率低于低表達(dá)組，這與 circRREB1 作為致癌因子的作用一致（補(bǔ)充圖 S4E，F(xiàn)）。由于 ALYREF 可以作為 circRREB1 的 m5C 修飾的讀取蛋白來調(diào)節(jié) circRREB1 的核輸出，因此我們過表達(dá) circRREB1 并同時(shí)沉默 ALYREF。在 ALYREF 被沉默后，circRREB1 的核輸出減少，HSPA8 的表達(dá)也降低，這通過蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)；值得注意的是，這些變化在 circRREB1 過表達(dá)的情況下又恢復(fù)了原狀（圖 6K、L）。

   許多研究表明，circRNAs 可通過泛素-蛋白酶體途徑調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)。首先，我們用 CHX 抑制蛋白質(zhì)合成。與對(duì)照組相比，circRREB1 缺失組的 HSPA8 蛋白穩(wěn)定性較差，半衰期更短（圖 6M、補(bǔ)充圖 S4G）。當(dāng)我們添加蛋白酶體抑制劑 MG132 時(shí)，我們發(fā)現(xiàn) circRREB1 無法調(diào)節(jié) HSPA8 的表達(dá)（圖 6N）。我們進(jìn)行了共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步研究 circRREB1 對(duì)泛素化 HSPA8 水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 circRREB1 缺失的細(xì)胞中，泛素化 HSPA8 的水平顯著增加（圖 6O）。通過上述實(shí)驗(yàn)，我們闡明了 circRREB1 可以靶向 HSPA8 并通過控制其泛素化來調(diào)節(jié)其表達(dá)。我們進(jìn)行了分子對(duì)接預(yù)測(cè)和共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，以確定 HSPA8 是否直接與 PINK1 結(jié)合，結(jié)果表明 HSPA8 可以直接與 PINK1 結(jié)合（圖 6P、Q）。

圖6.circRREB1與HSPA8蛋白結(jié)合，抑制其泛素化和降解

7.circRREB1 通過 HSPA8 調(diào)節(jié) PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬，從而促進(jìn)肺癌的發(fā)展

   我們之前的研究表明，circRREB1 能夠靶向并調(diào)節(jié) HSPA8 蛋白的表達(dá)，而 HSPA8 能夠直接與 PINK1 結(jié)合。我們?cè)O(shè)計(jì)了拯救實(shí)驗(yàn)，以探究 circRREB1 是否通過 HSPA8 來調(diào)節(jié) PINK1 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而通過調(diào)節(jié)線粒體自噬來促進(jìn)肺癌的發(fā)展。我們通過沉默 circRREB1 并同時(shí)過表達(dá) HSPA8 來檢測(cè)與 PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬相關(guān)的蛋白質(zhì)。WB 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，HSPA8 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了因沉默 circRREB1 而導(dǎo)致的線粒體自噬相關(guān)蛋白質(zhì) PINK1、Parkin 和 LC3 表達(dá)的降低（圖 7A，補(bǔ)充圖 S4H-J）。

   隨后，我們抑制了 circRREB1 的表達(dá)，同時(shí)過量表達(dá) PINK1，并進(jìn)行了一系列功能測(cè)試，以探究 circRREB1 通過 PINK1 促進(jìn)肺癌發(fā)展的能力。首先，我們通過檢測(cè)線粒體與溶酶體的共定位來測(cè)定細(xì)胞中的線粒體自噬水平。結(jié)果表明，PINK1 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了由 circRREB1 滅活所引起的線粒體自噬減少現(xiàn)象（圖 7B，補(bǔ)充圖 S4K）。我們進(jìn)行了 EdU 檢測(cè)以檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，并發(fā)現(xiàn)過表達(dá) PINK1 逆轉(zhuǎn)了由 circRREB1 滅活所引起的細(xì)胞增殖能力下降（圖 7C，D）。我們使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果表明 PINK1 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了由 circRREB1 滅活所引起的細(xì)胞凋亡增加（圖 7E，F(xiàn)）。我們進(jìn)行了 Transwell 檢測(cè)以檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，結(jié)果表明 PINK1 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了由 circRREB1 滅活所引起的細(xì)胞遷移能力下降（圖 7G，補(bǔ)充圖 S4L）。總之，circRREB1 可通過靶向 HSPA8 增加 PINK1 的表達(dá)水平，從而引發(fā)線粒體自噬，并最終促進(jìn)肺癌的發(fā)展（圖 7H）。

圖7.circRREB1 通過HSPA8 調(diào)節(jié) PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬，從而促進(jìn)肺癌的發(fā)展

結(jié)論

   這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，circRREB1上存在m5C修飾，并表明m5C修飾的circRREB1能夠誘導(dǎo)線粒體自噬，從而促進(jìn)肺癌的發(fā)生。這些發(fā)現(xiàn)不僅為進(jìn)一步探究肺癌發(fā)展背后的機(jī)制提供了理論依據(jù)，也為肺癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

Cai D, Chen X, Xu H, Zhao Q, Zhou X, Wu J, Yuan S, Gao Y, Li D, Zhang R, Peng W, Li G, Nan A. m5C-modified circRREB1 promotes lung cancer progression by inducing mitophagy. J Exp Clin Cancer Res. 2025 Jul 14;44(1):203. doi: 10.1186/s13046-025-03460-1. PMID: 40653497; PMCID: PMC12257754.