m6A閱讀器IGF2BP2穩(wěn)定的lncRNA LHX1-DT抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和侵襲

   m6A已被確定為多種人類癌癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。然而，m6A修飾在腎癌（RCC）中的作用及其與長(zhǎng)鏈非編碼RNA LHX1-DT （LHX1-DT）的相互作用尚不清楚。通過(guò)微陣列分析鑒定差異表達(dá)的lncRNA和m6A水平。通過(guò)RNA免疫沉淀和熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)IGF2BP2與LHX1-DT的相互作用。在RCC組織中發(fā)現(xiàn)LHX1-DT表達(dá)下調(diào)，并且LHX1-DT表達(dá)降低與RCC患者總生存率較差相關(guān)。功能實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)LHX1- DT可顯著抑制RCC細(xì)胞的增殖和侵襲。METTL14介導(dǎo)的m6A讀取器蛋白IGF2BP2識(shí)別LHX1-DT上的m6A修飾位點(diǎn)，促進(jìn)其穩(wěn)定性。此外，LHX1-DT通過(guò)海綿化miR-590-5p作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA (ceRNA)，進(jìn)而下調(diào)PDCD4，從而抑制RCC細(xì)胞的增殖和侵襲。LHX1-DT作為RCC的獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志物，IGF2BP2/LHX1-DT/miR-590-5p/PDCD4軸代表了RCC進(jìn)展的新治療靶點(diǎn)。本文于2025年6月發(fā)表于npj precision oncology（IF=8.0）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）在RCC組織和細(xì)胞系中m6A水平下調(diào)

   最近的進(jìn)展表明，m6甲基化參與了各種人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展。為了進(jìn)一步研究這一點(diǎn)，我們?cè)u(píng)估了RCC組織和細(xì)胞系中的m6A水平。采用比色法檢測(cè)RCC組織、鄰近正常腎組織、正常腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）、293 T細(xì)胞和RCC細(xì)胞系（Caki-1、786-O和ACHN）中m6A的總體水平。結(jié)果顯示，RCC組織和細(xì)胞系的總體m6A水平明顯低于鄰近正常腎組織、HK-2細(xì)胞和293 T細(xì)胞（圖1A， B）。接下來(lái)，我們檢測(cè)了RCC組織和鄰近正常腎組織中METTL3、METTL14、WTAP、FTO、ALKBH5等關(guān)鍵m6A調(diào)節(jié)因子的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，RCC組織中METTL14的mRNA和蛋白表達(dá)明顯低于鄰近正常腎組織（圖1C， D）。隨后，我們?cè)u(píng)估了mettl14在HK-2細(xì)胞、293 T細(xì)胞和RCC細(xì)胞系中的表達(dá)。結(jié)果表明，METTL14mRNA在RCC細(xì)胞系中的表達(dá)明顯低于HK-2細(xì)胞和293 T細(xì)胞（圖1E）。western blot在RCC組織和細(xì)胞系中也觀察到類似的結(jié)果（圖1F，G）。同時(shí)，將METTL14過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Caki-1細(xì)胞中（圖1H）。結(jié)果表明，在Caki-1細(xì)胞中，METTL14過(guò)表達(dá)后m6A水平顯著升高（圖1I）。這些發(fā)現(xiàn)表明，RCC組織和細(xì)胞系中m6A水平的下調(diào)可能在調(diào)節(jié)RCC的發(fā)生和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。

2）LHX1-DT是由m6A修飾調(diào)控的關(guān)鍵靶基因，與RCC患者預(yù)后不良有關(guān)

   最近的研究表明m6A修飾與lncRNA表達(dá)密切相關(guān)。幾個(gè)研究小組發(fā)現(xiàn)m6A修飾可以通過(guò)影響lncRNA的穩(wěn)定性來(lái)調(diào)節(jié)其表達(dá)。鑒于此，我們對(duì)3對(duì)RCC組織和鄰近正常腎組織進(jìn)行了m6A-mRNA和lncRNA表轉(zhuǎn)錄組微陣列分析。結(jié)果顯示，m6A水平在2290個(gè)lncRNA中上調(diào)，在1660個(gè)lncRNA中下調(diào)。圖2A列出了m6A水平上調(diào)前10位和下調(diào)前15位的lncRNA，其中m6A水平下調(diào)最明顯的是LHX1-DT。兩組的差異表達(dá)基因（DEGs）顯示在火山圖中（圖2B）。同時(shí)，進(jìn)行另一項(xiàng)微陣列分析，比較上述3對(duì)樣品之間的lncRNA表達(dá)譜。結(jié)果顯示，兩組分別有1688個(gè)lncRNA上調(diào)，2931個(gè)lncRNA下調(diào)。圖2C列出了上調(diào)和下調(diào)最多的15個(gè)lncRNA。值得注意的是，LHX1-DT在RCC組織中的表達(dá)明顯低于配對(duì)相鄰正常腎組織?；鹕綀D顯示了兩組之間的DEG（圖2D）。隨后，我們?cè)u(píng)估了RCC組織和細(xì)胞系中LHX1-DT的m6A水平。使用m6A抗體從RCC組織、鄰近正常腎組織、HK-2細(xì)胞和RCC細(xì)胞系（Caki-1、786-O和ACHN）中拉下m6A修飾RNA，meRIP檢測(cè)LHX1-DT的水平。結(jié)果顯示，RCC組織和細(xì)胞系中LHX1-DT的m6A水平明顯低于配對(duì)相鄰的正常腎組織和HK-2細(xì)胞（圖2E，F(xiàn)）。正如預(yù)期的那樣，LHX1-DT在RCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)明顯低于配對(duì)相鄰的正常腎組織和HK-2細(xì)胞（圖2G，H）。Kaplan-Meier分析進(jìn)一步顯示，在RCC患者中，高LHX1-DT表達(dá)與更好的OS相關(guān)（圖2I）。這些發(fā)現(xiàn)提示LHX1-DT是一種受m6A修飾調(diào)控的獨(dú)立預(yù)后因子，其表達(dá)與RCC患者預(yù)后良好相關(guān)。

3）LHX1-DT在體外和體內(nèi)均能抑制RCC細(xì)胞的增殖和侵襲

   為了研究LHX1-DT在RCC中的生物學(xué)功能，我們進(jìn)行了細(xì)胞增殖和侵襲實(shí)驗(yàn)。首先，用功能性LHX1-DT-cDNA和LHX1-DT-shRNA轉(zhuǎn)染786-O和Caki-1細(xì)胞。qRT-PCR結(jié)果證實(shí)LHX1-DT表達(dá)得到有效調(diào)控（圖3A，B）。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在786-O和Caki-1細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)LHX1-DT可顯著抑制細(xì)胞增殖，而敲低LHX1-DT可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖（圖3C，D）。同樣，在786-O和Caki-1細(xì)胞中進(jìn)行的transwell侵襲試驗(yàn)也得到了類似的結(jié)果（圖3E，F(xiàn)）。這些數(shù)據(jù)表明，LHX1-DT在體外抑制RCC細(xì)胞的增殖和侵襲。為了進(jìn)一步探討LHX1-DT在體內(nèi)的作用，我們建立了原位異種移植小鼠模型來(lái)驗(yàn)證LHX1-DT的抗腫瘤作用。用熒光素酶標(biāo)記Caki-1細(xì)胞并轉(zhuǎn)染功能性LHX1-DT-cDNA。然后將這些細(xì)胞注射到裸鼠的腎包膜中。使用體內(nèi)成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)腫瘤大小。6周后，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LHX1-DT過(guò)表達(dá)組的腫瘤生長(zhǎng)、體積和重量均顯著減少（圖3G-I）。此外，與對(duì)照組相比，LHX1-DT過(guò)表達(dá)組Ki67染色降低（圖3J）。qRT-PCR分析證實(shí)，過(guò)表達(dá)組LHX1-DT表達(dá)升高（圖3K）。綜上所述，上述數(shù)據(jù)表明LHX1-DT在體外和體內(nèi)均能抑制RCC細(xì)胞的增殖和侵襲。

4）LHX1-DT作為ceRNA吸收miR-590-5p

   為了探索LHX1-DT如何發(fā)揮其功能，我們使用在線工具lncATLAS預(yù)測(cè)了其亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明LHX1-DT主要定位于細(xì)胞質(zhì)中（圖4A）。核細(xì)胞質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一點(diǎn)（圖4B）， FISH實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一點(diǎn)（圖4C）。最近的研究報(bào)道，細(xì)胞質(zhì)lncRNA在人類癌癥中既可以作為腫瘤抑制因子，也可以作為致癌基因，通常作為miRNA海綿發(fā)揮作用。因此，我們假設(shè)LHX1-DT可能通過(guò)海綿miRNA抑制RCC細(xì)胞的增殖和侵襲。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們使用特異性抗AGO2抗體進(jìn)行了RIP實(shí)驗(yàn)，AGO2抗體是miRNA介導(dǎo)的mRNA翻譯抑制和不穩(wěn)定復(fù)合物的關(guān)鍵成分（圖4D）。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，內(nèi)源性LHX1- DT AGO2的富集程度更高（圖4E）。這些數(shù)據(jù)表明LHX1-DT可能作為ceRNA抑制RCC細(xì)胞的發(fā)育。然后，我們尋找可能與LHX1- DT結(jié)合的潛在miRNA。使用DIANA Tools，預(yù)測(cè)51個(gè)miRNA與LHX1-DT相互作用。通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（GSE12105）分析，其中40種miRNA在RCC組織中與鄰近正常腎組織存在差異表達(dá)。在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中，miR-590-5p和miR-545-5p被鑒定為常見(jiàn)的miRNA（圖4F）。qRT-PCR分析顯示，與鄰近正常腎組織相比，miR-590-5p在52對(duì)RCC組織中顯著上調(diào)，而miR-545-5p無(wú)顯著變化（圖4G）。RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)AGO2可以與miR-590-5p相互作用（圖4H）。因此，我們選擇miR-590-5p進(jìn)行進(jìn)一步研究。為了探究LHX1-DT是否是ago2-miR-590-5p復(fù)合物的一部分，我們進(jìn)行了AGO2實(shí)驗(yàn)。結(jié)果證實(shí)，LHX1-DT在miR-590-5p模擬物組中更富集（圖4I）。接下來(lái)，我們發(fā)現(xiàn)在RCC組織和鄰近正常腎組織中，miR-590-5p水平與LHX1-DT表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖4J）。LHX1-DT過(guò)表達(dá)導(dǎo)致miR-590-5p顯著下調(diào)，而LHX1-DT沉默導(dǎo)致miR-590-5p上調(diào)（圖4K，L）。采用野生型（LHX1-DT-WT）和突變型miR-590-5p結(jié)合位點(diǎn)（LHX1-DT-MUT）設(shè)計(jì)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)（圖4M)。結(jié)果表明，野生型組的熒光素酶活性在miR-590-5p模擬物處理后顯著降低，而突變組的熒光素酶活性保持不變，這表明LHX1-DT以序列特異性的方式靶向miR-590-5p（圖4N，O）。此外，生物素偶聯(lián)miR-590-5p成功拉下LHX1-DT的結(jié)合，而生物素偶聯(lián)LHX1-DT在786-O和Caki-1細(xì)胞中成功拉下miR-590-5p（圖4P）。隨后，進(jìn)行了一項(xiàng)拯救實(shí)驗(yàn)來(lái)研究miR-590-5p在RCC細(xì)胞增殖和侵襲中的作用。過(guò)表達(dá)miR-590-5p促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲，而上調(diào)LHX1-DT部分逆轉(zhuǎn)了miR-590-5p對(duì)RCC細(xì)胞增殖和侵襲的促進(jìn)作用（圖4Q，R）。相反，沉默miR-590-5p抑制細(xì)胞增殖和侵襲，LHX1-DT沉默部分逆轉(zhuǎn)了miR-590-5p對(duì)786-O和Caki-1細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用（圖4S，T）。上述數(shù)據(jù)共同表明，LHX1-DT作為miR-590-5p的miRNA海綿，從而調(diào)節(jié)RCC的進(jìn)展。

5）IGF2BP2結(jié)合LHX1-DT并以依賴m6A的方式調(diào)控其表達(dá)

   我們發(fā)現(xiàn)lncRNA可能是通過(guò)m6A修飾機(jī)制調(diào)控的靶標(biāo)，盡管確切的潛在機(jī)制仍然很復(fù)雜。在此基礎(chǔ)上，我們研究了LHX1-DT的m6A修飾。qRT-PCR結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)METTL14顯著增加了786-O和Caki-1細(xì)胞中m6A水平和LHX1-DT表達(dá)（圖5A，B）。在RCC組織中也觀察到METTL14和LHX1-DT水平呈正相關(guān)（圖5C）。這些發(fā)現(xiàn)表明m6A修飾在LHX1-DT的下調(diào)中起作用。接下來(lái)，我們檢測(cè)了METTL14操作后LHX1-DT的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在actinomycin-D處理的786-O和Caki-1細(xì)胞中，METTL14的敲低顯著降低了LHX1-DT的半衰期（圖5D，E），表明METTL14通過(guò)調(diào)節(jié)LHX1-DT的穩(wěn)定性來(lái)調(diào)節(jié)LHX1-DT的表達(dá)。因此，我們研究了能夠識(shí)別甲基化LHX1-DT并調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性的潛在m6A讀取器。最近的研究表明，IGF2BP家族可以識(shí)別m6A修飾并增加RNA穩(wěn)定性。RIP實(shí)驗(yàn)顯示LHX1-DT顯著富集IGF2BP2，而不是IGF2BP1和IGF2BP3（圖5F）。METTL14的缺失降低了IGF2BP2中LHX1-DT的富集（圖5G），表明METTL14誘導(dǎo)的m6A修飾調(diào)節(jié)了IGF2BP2對(duì)甲基化LHX1-DT的識(shí)別。同時(shí)，抑制IGF2BP2降低了786- O和Caki-1細(xì)胞中LHX1-DT的半衰期（圖5H，I），結(jié)果與METTL14敲除相似。這些數(shù)據(jù)表明IGF2BP2作為L(zhǎng)HX1- DT的m6A讀取器起作用。接下來(lái)，根據(jù)GEPIA2數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)IGF2BP2表達(dá)在RCC中下調(diào)（圖5J）。此外，為了研究SRAMP預(yù)測(cè)的潛在m6A修飾位點(diǎn)是否與LHX1-DT和IGF2BP2之間的相互作用有關(guān)，我們突變了所有預(yù)測(cè)的m6A修飾位點(diǎn)（圖5K）。RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LHX1-DT與IGF2BP2之間的直接結(jié)合被它們的修飾位點(diǎn)突變所破壞（圖5L）。m6A修飾位點(diǎn)突變后，METTL14或IGF2BP2介導(dǎo)的LHX1-DT調(diào)節(jié)功能受損（圖5M）。為了確定哪個(gè)特定的m6A修飾位點(diǎn)負(fù)責(zé)穩(wěn)定LHX1-DT，設(shè)計(jì)了三個(gè)LHX1-DT突變體（圖5N）。熒光素酶報(bào)告基因分析顯示，1號(hào)位點(diǎn)（UUGGACU）在調(diào)節(jié)LHX1-DT穩(wěn)定性中起著關(guān)鍵作用（圖5O）。綜上所述，IGF2BP2以依賴m6A的方式結(jié)合LHX1-DT并增強(qiáng)其穩(wěn)定性。

6）LHX1-DT通過(guò)靶向miR-590-5p/ PDCD4軸抑制RCC進(jìn)展

   為了研究LHX1-DT/miR-590-5p軸在RCC進(jìn)展中的機(jī)制，我們使用了三種在線分析工具并鑒定了11種可能成為miR-590-5p靶點(diǎn)的mRNA，包括PDCD4（圖6A），一種已知的RCC中的腫瘤抑制因子。qRT-PCR結(jié)果顯示，與鄰近正常腎組織相比，RCC組織中PDCD4和BTG2的表達(dá)水平較低，其中PDCD4的表達(dá)下降更為明顯（圖6B）。使用52個(gè)配對(duì)的RCC樣本，我們證實(shí)，與鄰近的正常腎組織相比，RCC組織中的PDCD4表達(dá)顯著降低（圖6C）。KM分析結(jié)果顯示，低PDCD4水平表明較差的OS（圖6D）。此外，發(fā)現(xiàn)miR-590-5p水平與RCC組織中PDCD4表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖6E）。我們還觀察到，在786-O和Caki-1細(xì)胞中，通過(guò)引入miR-590-5p模擬物或抑制劑，PDCD4的mRNA和蛋白水平分別下調(diào)或上調(diào)（圖6F，G）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-590-5p在PDCD4 3 '-UTR的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)，我們進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（圖6H）。結(jié)果顯示，miR- 590-5模擬物處理后PDCD4-WT構(gòu)建物的熒光素酶活性顯著降低，而PDCD4-MUT構(gòu)建物的活性保持不變（圖6I，J）。在786-O和Caki-1細(xì)胞中，PDCD4過(guò)表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了miR-590-5p模擬物對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲的促進(jìn)作用（圖6K，L），而PDCD4敲低部分逆轉(zhuǎn)了miR-590-5p抑制劑對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用（圖6M， N）。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)pdcd4是miR-590-5p的直接靶點(diǎn)。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)RCC組織中PDCD4與LHX1- DT表達(dá)呈正相關(guān)（圖6O）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染功能性LHX1-DT-cDNA或LHX1-DT-shRNA進(jìn)入786-O和Caki-1細(xì)胞后，PDCD4蛋白和mRNA水平分別上調(diào)或下調(diào)（圖6P，Q）。過(guò)表達(dá)LHX1-DT部分逆轉(zhuǎn)了miR-590-5p模擬物對(duì)PDCD4表達(dá)的抑制作用（圖6R，S），而敲低LHX1-DT部分逆轉(zhuǎn)了miR-590-5p抑制劑在蛋白質(zhì)和mRNA水平上對(duì)PDCD4表達(dá)的促進(jìn)作用（圖6T，U）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明LHX1-DT對(duì)RCC進(jìn)展的抑制作用主要是通過(guò)miR-590-5p/PDCD4軸介導(dǎo)的。

7）PDCD4負(fù)責(zé)LHX1-DT介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和侵襲抑制

   為了研究LHX1-DT是否以PDCD4依賴的方式抑制RCC進(jìn)展，我們?cè)?86-O和Caki-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了功能性LHX1-DT-cDNA和PDCD4敲低載體。結(jié)果顯示，PDCD4下調(diào)部分逆轉(zhuǎn)了LHX1-DT過(guò)表達(dá)對(duì)RCC細(xì)胞增殖的抑制作用（圖7A）。在786-O和Caki-1細(xì)胞中使用transwell侵襲實(shí)驗(yàn)獲得了類似的結(jié)果（圖7B）。相反，PDCD4的上調(diào)部分逆轉(zhuǎn)了LHX1-DT敲低對(duì)RCC細(xì)胞增殖和侵襲的促進(jìn)作用（圖7C，D）。這些發(fā)現(xiàn)表明，LHX1-DT作為腫瘤抑制lncRNA，通過(guò)miR-590-5p/PDCD4信號(hào)通路抑制RCC細(xì)胞增殖和侵襲。

結(jié)論：

   我們的研究闡明了m6A修飾和lncRNA在調(diào)控RCC增殖和侵襲中的關(guān)鍵作用。我們證明m6Areader IGF2BP2可以通過(guò)識(shí)別特定的m6A修飾位點(diǎn)來(lái)增加LHX1-DT的穩(wěn)定性，從而通過(guò)miR-590-5p/PDCD4軸抑制RCC的進(jìn)展。這些發(fā)現(xiàn)突出了m6A修飾的LHX1-DT的功能意義，并為m6A甲基化對(duì)RCC的表觀遺傳調(diào)控提供了新的見(jiàn)解。

參考文獻(xiàn)：

Zhu C, Li R, You X, Xu J, Wang J, Dong D, Chen X, Wang K. m6A reader IGF2BP2-stabilized lncRNA LHX1-DT inhibits renal cell carcinoma (RCC) cell proliferation and invasion by sponging miR-590-5p. NPJ Precis Oncol. 2025 Jun 17;9(1):193. doi: 10.1038/s41698-025-00958-x.