膀胱癌中巨噬細(xì)胞與癌細(xì)胞之間ERα依賴性crosstalk增強(qiáng)血管生成擬態(tài)和M2巨噬細(xì)胞極化

   膀胱癌（BLCA）的發(fā)生和發(fā)展中存在與性別相關(guān)的差異，這受到性激素及其受體信號通路的影響。針對血管內(nèi)皮生長因子的血管生成抑制劑在膀胱癌患者中并未顯示出治療效果。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)雌激素受體α（ERα）的表達(dá)與血管擬態(tài)（VM）的形成以及M2 型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）的浸潤呈正相關(guān)。然而，目前尚不清楚ERα 與巨噬細(xì)胞之間的這種聯(lián)系如何影響 VM 及其詳細(xì)機(jī)制。我們的體外研究結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的ERα 表達(dá)上調(diào)通過轉(zhuǎn)錄上調(diào) CDH5 促進(jìn)BLCA 細(xì)胞的 VM。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，BLCA細(xì)胞中上調(diào)的 ERα 通過腫瘤細(xì)胞衍生的外泌體激活PTEN/PI3K/pAKT 通路，誘導(dǎo)M2 巨噬細(xì)胞的極化。機(jī)制研究揭示，由 ERα 在BLCA 細(xì)胞中上調(diào)產(chǎn)生的外泌體 miR-642a-5p 通過直接靶向PTEN mRNA 的3'UTR 降低巨噬細(xì)胞中的 PTEN 表達(dá)。涉及體外BLCA 細(xì)胞系和體內(nèi)小鼠異種移植模型的臨床前實驗證實了這一新發(fā)現(xiàn)的通路及其反饋回路，為BLCA 的創(chuàng)新治療策略的開發(fā)提供了新的思路。。該研究于2025年7月發(fā)表在《Cell Communication and Signaling》，IF：8.9。

技術(shù)路線

1.在BLCA中，ERα的表達(dá)與TAMs的浸潤呈正相關(guān)

   巨噬細(xì)胞是多種實體腫瘤（包括 BLCA 在內(nèi)）中常見的浸潤性免疫細(xì)胞群體。為了探究巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的作用及其對 BLCA 發(fā)展的影響，我們首先使用 TIMER2.0 數(shù)據(jù)集評估了巨噬細(xì)胞浸潤的預(yù)后意義。我們的分析表明，巨噬細(xì)胞浸潤水平較高的 BLCA 患者生存率低于浸潤水平較低的患者（圖 1A）。在評估 M2 型巨噬細(xì)胞浸潤的預(yù)后價值時也觀察到了類似的結(jié)果（圖 1B）。鑒于 BLCA 的發(fā)病率和預(yù)后在男性和女性之間存在差異，我們進(jìn)一步分別對男性和女性 BLCA 患者的 M2 型巨噬細(xì)胞浸潤的預(yù)后相關(guān)性進(jìn)行了詳細(xì)研究。在女性患者中，M2 型巨噬細(xì)胞浸潤水平較高的患者生存率低于水平較低的患者（圖 1C），而在男性患者中，兩組之間未觀察到顯著差異（圖 1A）。此外，我們的分析表明，女性BLCA患者體內(nèi)的 M2 型巨噬細(xì)胞浸潤程度高于男性患者（圖 1D）。我們接著利用 TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫研究了激素受體與巨噬細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系。我們的研究結(jié)果表明，ERα 的轉(zhuǎn)錄基因 ESR1 與巨噬細(xì)胞浸潤以及 BLCA 中的 M2 型巨噬細(xì)胞浸潤之間存在正相關(guān)關(guān)系（圖 1E）。然而，M2 型巨噬細(xì)胞浸潤與 ESR2 或 AR 的表達(dá)并無顯著相關(guān)性（圖 1B）。

   通過使用在線工具 TRGAted，我們分析了 ERα 表達(dá)與 BLCA 患者生存率之間的關(guān)聯(lián)。根據(jù) TRGAted 分析結(jié)果，ERα 表達(dá)水平高的 BLCA 患者生存率更低（圖 1F）。在 III 和 IV 期的晚期 BLCA 患者中，ERα 表達(dá)水平較高的患者生存率更差，尤其是女性患者（圖 1G）。然而，在早期階段（I 和 II 期）的 BLCA 患者中，ERα 的較高表達(dá)水平與更好的生存率相關(guān)（圖 1C）。上述結(jié)果表明，ERα 在晚期 BLCA 中可能與早期 BLCA 中發(fā)揮的作用不同。

   根據(jù) TCGA 數(shù)據(jù)集的不同臨床階段，對 TAMs 標(biāo)記物 CD68 和 CD163 的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，與 II 期患者相比，III 和 IV 期患者的這兩種標(biāo)記物的表達(dá)顯著增加（圖 1H）。根據(jù)我們對 GSE13507 的分析結(jié)果，CD163 在原發(fā)性 BLCA 腫瘤和復(fù)發(fā)性腫瘤中的表達(dá)與 ESR1 的表達(dá)呈正相關(guān)，且具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖 1D）。為了闡明TAMs浸潤與膀胱癌組織中ERα表達(dá)之間的關(guān)系，我們對 40 例膀胱癌（BLCA）患者樣本（包括 24 例肌層浸潤性膀胱癌（MIBC）樣本和 16 例非肌層浸潤性膀胱癌（NMIBC）樣本）的 CD68/CD163 和 ERα 表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明 ERα 的表達(dá)與 TAMs 浸潤呈正相關(guān)（圖 1I-J）。我們還發(fā)現(xiàn)，MIBC 樣本中的 CD163 表達(dá)明顯高于 NMIBC 樣本（圖 1K）。MIBC 樣本中 ERα 陽性樣本的比例顯著高于 NMIBC 樣本（圖 1L）。

圖1.在BLCA中，ERα的表達(dá)與TAMs的浸潤呈正相關(guān)

2.TAMs增加ERα的表達(dá)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的血管生成擬態(tài)

   我們之前的研究表明， TAMs會促進(jìn)腎細(xì)胞癌中的VM形成。VM被認(rèn)為與癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移以及對抗血管治療的不敏感性或耐藥性有關(guān)。為了探究BLCA中 TAMs 與VM之間的關(guān)系，我們根據(jù)我們發(fā)表的論文中的方法建立了體外共培養(yǎng)系統(tǒng)。首先，我們檢測了四種不同膀胱癌細(xì)胞系（J82、TCC-SUP、T24 和 UMUC-3）中 ERα 的表達(dá)水平以及形成VM的能力。結(jié)果表明，TCC-SUP 細(xì)胞系的 ERα 表達(dá)水平和形成VM的能力最強(qiáng)，其次是 UMUC-3 細(xì)胞，然后是 T24 細(xì)胞。T24 細(xì)胞的 ERα 表達(dá)水平和形成VM的能力低于 UMUC-3 和 TCC-SUP 細(xì)胞，而 J82 細(xì)胞在體外實驗中無法形成管狀結(jié)構(gòu)（圖 2 A-B）。因此，我們選擇了 TCC-SUP 細(xì)胞和 T24 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

   如圖 2A 和 2B 所示，與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)顯著增強(qiáng)了 T24 和 TCC-SUP 細(xì)胞形成二維和三維VM結(jié)構(gòu)的能力。我們評估了與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后 BLCA 細(xì)胞中 ERα 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示 ERα 的表達(dá)顯著增加（圖 2C）。為了驗證 ERα 在巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的VM形成中的作用，我們進(jìn)行了實驗來評估二維和三維VM形成的能力。我們將用 ERα 敲低載體（ERα-KD）產(chǎn)生的慢病毒轉(zhuǎn)染的 TCC-SUP 細(xì)胞與用正常對照載體（NC）產(chǎn)生的慢病毒轉(zhuǎn)染的 TCC-SUP 細(xì)胞進(jìn)行比較。將用 ERα cDNA 載體（ERα-OE）產(chǎn)生的慢病毒轉(zhuǎn)染的 T24 細(xì)胞與用 pWPI cDNA 載體（NC）產(chǎn)生的慢病毒轉(zhuǎn)染的 T24 細(xì)胞進(jìn)行比較。結(jié)果表明，降低 ERα 的表達(dá)會阻礙二維和三維VM的形成，而提高其表達(dá)則會促進(jìn)VM的形成（圖 2D-F）。

   為探究巨噬細(xì)胞是否通過上調(diào) ERα 的表達(dá)來促進(jìn)VM的形成，我們進(jìn)行了拯救實驗。我們將 ERα 缺失型慢病毒轉(zhuǎn)染至 TCC-SUP 細(xì)胞中，然后將這些細(xì)胞與或不與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。隨后，收集腫瘤細(xì)胞進(jìn)行 2D/3D VM形成實驗。結(jié)果表明，敲低 ERα 可逆轉(zhuǎn)與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)所誘導(dǎo)的VM形成增強(qiáng)現(xiàn)象（圖 2G-H）。此外，我們使用雌激素受體抑制劑 ICI-182，780 進(jìn)行了拯救實驗。結(jié)果顯示，通過 ICI-182，780 抑制 ERα 也能逆轉(zhuǎn)與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)所誘導(dǎo)的VM形成增強(qiáng)現(xiàn)象（圖 2C）。我們還進(jìn)行了進(jìn)一步實驗，以檢查 ERα 基因敲除（ERα-KO）和野生型（WT）小鼠的 BBN 誘導(dǎo)的 BLCA 腫瘤中巨噬細(xì)胞標(biāo)志物 F4/80 和VM標(biāo)志物 PAS+/CD31- 的存在情況（圖 2I）。WT 樣本中 MIBC 的比例顯著高于 ERα-KO 組（圖 2J）。我們的結(jié)果表明，與 WT 腫瘤相比，ERα-KO 腫瘤的VM形成顯著減少（圖 2K），并且VM形成與巨噬細(xì)胞浸潤之間存在正相關(guān)關(guān)系（圖 2L）。綜合來看，圖 2A-L 和圖 S2A-C 的結(jié)果表明，ERα 起到了促甲狀腺上皮瘤形成的作用，即它充當(dāng)了TAM促進(jìn)VM形成的媒介。

圖2.巨噬細(xì)胞增加BLCA細(xì)胞ERα表達(dá)，促進(jìn)VM形成

3.ERα通過上調(diào)CDH5促進(jìn)VM形成

   為闡明巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的 ERα 如何促進(jìn)VM形成的具體機(jī)制，我們在 T24 和 TCC-SUP 細(xì)胞中（無論是否與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)）分別在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上鑒定出了 12 種已知的與VM形成相關(guān)的分子（圖 3A-B）。結(jié)果顯示，共培養(yǎng)的 T24 和 TCC-SUP 細(xì)胞中 CDH5 的表達(dá)顯著增加。為了進(jìn)一步探究 ERα 是否能調(diào)節(jié) CDH5，我們進(jìn)行了更多的實驗。這些實驗表明，敲低 ERα 的表達(dá)會導(dǎo)致 CDH5 表達(dá)的降低，而 ERα 的過表達(dá)則會產(chǎn)生相反的效果（圖 3C）。根據(jù)在線的 TCGA 數(shù)據(jù)庫，我們分析了 ESR1 和 CDH5 在 BLCA 中的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)這兩個基因之間存在顯著的正相關(guān)（圖 3D）。此外，我們還研究了 ESR1 和 CDH5 在 34 種不同癌癥類型中的關(guān)聯(lián)，結(jié)果在大多數(shù)癌癥類型中（包括 BLCA）都顯示出顯著的正相關(guān)（圖 3E）。

   為確認(rèn) ERα 是否通過調(diào)節(jié) CDH5 來促進(jìn)VM的形成，我們進(jìn)行了拯救實驗，實驗結(jié)果表明，在 T24 細(xì)胞中敲低 CDH5 的表達(dá)會減少VM的形成，并且能夠逆轉(zhuǎn)由 ERα 過度表達(dá)所導(dǎo)致的VM形成（圖 3F、G）。相反，在 TCC-SUP 細(xì)胞中過表達(dá) CDH5 會增強(qiáng)VM的形成，并且能夠逆轉(zhuǎn) ERα 抑制所導(dǎo)致的VM形成（圖 3A-B）。接下來，我們使用在線工具 UALCAN 根據(jù) TCGA 數(shù)據(jù)庫分析了 BLCA 患者的生存情況，結(jié)果顯示，CDH5 表達(dá)水平高的患者預(yù)后較差，尤其是女性患者（圖 3C）。此外，晚期（III 和 IV 期）患者的腫瘤組織中 CDH5 的表達(dá)明顯高于早期（II 期）患者（圖 3D）。接下來，我們通過 IHC 檢測了 BLCA 樣本中的 ERα 表達(dá)，然后將患者分為 ERα 陽性組和 ERα 陰性組（圖 3H）。如圖 3I-J 所示，ERα 陽性腫瘤組織中 CDH5 的表達(dá)和VM的形成明顯高于 ERα 陰性腫瘤組織。此外，ERα 的表達(dá)水平與 CDH5 的表達(dá)水平呈正相關(guān)（圖 3K）。綜合來看，圖 3A-K 和圖 S3A-D 中所呈現(xiàn)的結(jié)果表明，ERα 通過調(diào)節(jié) CDH5 的表達(dá)來影響VM的形成。

圖3.ERα通過上調(diào)CDH5促進(jìn)VM形成

4.ERα通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控調(diào)控CDH5表達(dá)的機(jī)制剖析

   為探究 ERα 如何調(diào)控 BLCA 細(xì)胞中的 CDH5，我們檢測了 TCC-SUP-ERα-KD 細(xì)胞與 TCC-SUP-NC 細(xì)胞以及 T24-ERα-OE 細(xì)胞與 T24-NC 細(xì)胞中 CDH5 的 mRNA 水平。結(jié)果顯示，CDH5 mRNA 水平的變化與其蛋白表達(dá)的變化一致（圖 4A），這表明轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能是主要機(jī)制。接下來，進(jìn)行了 ChIP 實驗以確定 ERα 是否能與 CDH5 啟動子結(jié)合并調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄。在 CDH5 啟動子的 3 千堿基區(qū)域內(nèi)鑒定出了三個預(yù)測的 ESR1 反應(yīng)元件（EREs），它們可能通過 ERα 結(jié)合發(fā)揮作用（圖 4B、C）。ChIP 結(jié)果表明，ERα 在 CDH5 啟動子區(qū)域與 ERE2 結(jié)合以啟動基因轉(zhuǎn)錄（圖 4D）。然后，我們使用含有野生型（WT）或突變型（Mut）ERE2 的 pGL3 報告質(zhì)粒進(jìn)行熒光素酶測定，以確認(rèn) ERE2 的功能。熒光素酶報告基因活性測定顯示，ERα 表達(dá)的下調(diào)降低了野生型報告基因轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性，而在突變組中沒有顯著變化。相反，ERα 的過表達(dá)僅在野生型報告基因轉(zhuǎn)染組中顯著提高了熒光素酶的活性（圖 4E、F）。綜上所述，圖4A-F的結(jié)果表明，ERα可以轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)BLCA細(xì)胞中CDH5的表達(dá)。

圖4.ERα通過轉(zhuǎn)錄上調(diào)CDH5的表達(dá)

5.巨噬細(xì)胞浸潤增加BLCA細(xì)胞ERα表達(dá)的機(jī)制剖析：通過IL-17 a介導(dǎo)的表觀遺傳機(jī)制

   眾多研究表明，巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子能夠影響腫瘤的生物學(xué)功能。我們的 qRT-PCR 分析顯示，在與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，T24 和 TCC-SUP 細(xì)胞中的 ESR1 mRNA 表達(dá)顯著增加，這表明 ERα 的上調(diào)可能是在轉(zhuǎn)錄水平上受到控制的（圖 5A）。我們篩選了在與或不與 BLCA 細(xì)胞共培養(yǎng)的條件下由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的十種潛在細(xì)胞因子（圖 5B）。隨后，我們在 T24 和 TCC-SUP 細(xì)胞中檢查了這五種升高的細(xì)胞因子，無論是否與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，最終確定 IL-17 A 和 TGFβ 為有前景的候選物（圖 5C）。值得注意的是，一項關(guān)于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中細(xì)胞因子對 ERα 表達(dá)調(diào)控的研究強(qiáng)調(diào)，IL-17 A 可通過刺激 ESR1 轉(zhuǎn)錄來增強(qiáng) ERα 表達(dá)。該研究還提出，IL-17 A 誘導(dǎo)的 ERα 表達(dá)可能與 TET1 介導(dǎo)的 ESR1 基因啟動子去甲基化有關(guān)。此外，我們使用 UALCAN分析了 ESR1 啟動子的甲基化水平。（http://ualcan.path.uab.edu/）公布了一項重要發(fā)現(xiàn)，即在BLCA腫瘤中，ESR1啟動子的甲基化水平顯著降低（圖4A）。此外，我們還對 TCGA 數(shù)據(jù)庫中不同臨床階段的 ESR1 啟動子甲基化水平進(jìn)行了評估，結(jié)果顯示，在晚期階段（II、III 和 IV 期）的甲基化水平明顯低于 I 期（圖4B）。鑒于上述發(fā)現(xiàn)以及我們之前的成果，我們提出以下假設(shè)：巨噬細(xì)胞可能通過一種涉及 IL-17A 介導(dǎo)的 TET1 依賴性 ESR1 啟動子去甲基化的表觀遺傳機(jī)制來提高 BLCA 細(xì)胞中的 ERα 表達(dá)。

   基于上述假設(shè)，我們試圖通過在共培養(yǎng)系統(tǒng)中引入 IL-17 A 受體抗體（IL17RA）來阻斷 IL-17 A 的功能，以驗證 IL-17 A 在 ERα 表達(dá)中的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，抑制 IL-17 A 的功能會減弱巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的 T24 和 TCC-SUP 細(xì)胞中 ERα 表達(dá)的上調(diào)（圖 5D）。隨后，蛋白質(zhì)印跡分析證實，添加外源性 IL-17 A 會導(dǎo)致 ERα 表達(dá)隨時間呈劑量依賴性增加（圖 5E，Sfig.4 C）。根據(jù)所提出的機(jī)制，IL-17 A 被認(rèn)為通過 TET1 介導(dǎo)的 5-羥甲基化途徑影響 ESR1 啟動子的去甲基化，從而上調(diào) ERα 表達(dá)。為了排除 IL-17 A 對 CDH5 的直接調(diào)節(jié)作用，并證明 IL-17 A 在 BLCA 中通過特異性上調(diào) ERα 的表達(dá)來促進(jìn) CDH-5 依賴性 VM 形成，我們向 ERα 基因敲低細(xì)胞中添加外源性IL-17 A 并檢測 CDH5 的表達(dá)。結(jié)果表明，敲低 ERα 表達(dá)會降低 CDH5 的表達(dá)，無論是否添加外源性 IL-17 A（Sfig. 4D）。為了進(jìn)一步探究這一現(xiàn)象，我們檢測了在敲低 TET1 表達(dá)后 BLCA 細(xì)胞中 ERα 的表達(dá)情況。值得注意的是，TET1 敲低顯著抑制了 ERα 的表達(dá)，并阻礙了VM的形成（圖 5F，S 圖 4E）。此外，在 BLCA 細(xì)胞中敲低 TET1 逆轉(zhuǎn)了巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的 ERα 表達(dá)上調(diào)和VM形成（圖 5G-H）。我們使用 GEPIA 對 BLCA 中 TET1 的預(yù)后價值進(jìn)行了評估，結(jié)果顯示高 TET1 表達(dá)的患者生存率更低，從而為 TET1 在 BLCA 中的促腫瘤作用提供了更多證據(jù)（S 圖 4F）。

圖5.巨噬細(xì)胞通過IL-17 a介導(dǎo)的表觀遺傳機(jī)制增加BLCA細(xì)胞中ERα的表達(dá)

6.來自BLCA細(xì)胞的ERα調(diào)節(jié)的腫瘤源性外泌體通過pten/pakt途徑促進(jìn)M2極化和IL-17 A的產(chǎn)生

   TAMs在炎癥反應(yīng)和腫瘤微環(huán)境中起著關(guān)鍵作用。在膀胱癌（BLCA）中，TAMs 的雙重作用取決于不同的極化狀態(tài)，即 M1/M2 類型。巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用已被證實能夠重塑腫瘤微環(huán)境并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。TAMs，尤其是 M2 型，被認(rèn)為在這一微環(huán)境中發(fā)揮著促進(jìn)腫瘤生長的作用。根據(jù)圖 1 的結(jié)果，發(fā)現(xiàn) ERα 的表達(dá)與 M2 型巨噬細(xì)胞的浸潤程度呈正相關(guān)。因此，我們假設(shè) ERα 是否參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的 M2 極化過程。為了進(jìn)一步驗證這一假設(shè)，我們檢查了在與或不與 BLCA 細(xì)胞共培養(yǎng)后巨噬細(xì)胞中 M1 和 M2 標(biāo)志物的表達(dá)情況。結(jié)果表明，共培養(yǎng)后大多數(shù) M2 標(biāo)志物的表達(dá)顯著增加，而 M1 標(biāo)志物的水平則降低（圖 6A）。隨后，我們檢測了在與轉(zhuǎn)染了/未轉(zhuǎn)染 ERα 過表達(dá)病毒的 T24 細(xì)胞或轉(zhuǎn)染了/未轉(zhuǎn)染 ERα 缺失病毒的 TCC-SUP 細(xì)胞共培養(yǎng)后巨噬細(xì)胞中 M2 標(biāo)志物的表達(dá)情況。正如預(yù)期的那樣，結(jié)果表明，在 T24 ERα-OE 共培養(yǎng)組中，M2 標(biāo)志物顯著增加，而在 TCC-SUP ERα-KD 共培養(yǎng)組中，M2 標(biāo)志物顯著減少，這表明在 BLCA 細(xì)胞中改變 ERα 的表達(dá)能夠有效地影響 M2 巨噬細(xì)胞的極化（圖 6B）。根據(jù)先前的研究，腫瘤來源的細(xì)胞外囊泡（EVs）包含諸如微小 RNA 等小分子，能夠介導(dǎo) M2 巨噬細(xì)胞的極化。為了確定腫瘤來源的外泌體在 M2 巨噬細(xì)胞極化中的作用，使用外泌體抑制劑 GW4869 來阻斷共培養(yǎng)系統(tǒng)中的外泌體功能。通過蛋白質(zhì)印跡法評估外泌體標(biāo)志物 CD63 和 CD9 的蛋白水平，并通過電子顯微鏡檢查腫瘤細(xì)胞來源的外泌體的形態(tài)，所有這些都證實了我們收集到的外泌體的存在（圖 6C，Sfig.5 A）。結(jié)果表明，在共培養(yǎng)系統(tǒng)中添加 GW4869 能夠顯著阻斷巨噬細(xì)胞的 M2 極化（圖 6D），并且添加來自 T24 ERα-OE 細(xì)胞的外泌體能夠顯著誘導(dǎo) M2 巨噬細(xì)胞極化（圖 6E）。

   鑒于在 BLCA 細(xì)胞中，M2 型巨噬細(xì)胞極化受到 ERα 表達(dá)的反饋調(diào)節(jié)，我們探究了其潛在的機(jī)制。多項研究表明，pAKT 介導(dǎo)的信號通路在 M2 極化調(diào)節(jié)中起著重要作用。有趣的是，PTEN/pAKT 軸也被報道能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中的 IL17 表達(dá)。為驗證 PTEN/pAKT 軸在促進(jìn) M2 巨噬細(xì)胞極化中的作用，我們檢測了用 T24-CM 和 TCC-SUP-CM 處理的巨噬細(xì)胞中 PTEN 和 pAKT 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，來自 T24 和 TCC-SUP 的細(xì)胞培養(yǎng)基的添加降低了巨噬細(xì)胞中 PTEN 的表達(dá)，并增加了 pAKT 的表達(dá)（圖 5B）。此外，我們發(fā)現(xiàn) T24 和 TCC-SUP 細(xì)胞衍生的外泌體能夠影響巨噬細(xì)胞中的 PTEN/pAKT 通路（圖 6F）。在共培養(yǎng)系統(tǒng)中添加 GW4869 使腫瘤細(xì)胞失去了調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中 PTEN/pAKT 通路的能力，而提供外泌體則逆轉(zhuǎn)了這種剝奪狀態(tài)（圖 6G）。此外，我們還檢測了用來自 T24 ERα-OE 細(xì)胞和 TCC-SUP ERα-KD 細(xì)胞的外泌體處理的巨噬細(xì)胞中 PTEN 和 pAKT 的表達(dá)情況。結(jié)果表明，加入 T24 ERα-OE 細(xì)胞來源的外泌體后 PTEN 的表達(dá)增加，而加入 TCC-SUP ERα-KD 細(xì)胞的外泌體后其表達(dá)降低，同時 pAKT 的表達(dá)與 PTEN 的表達(dá)變化方向相反（圖 6H）。巨噬細(xì)胞中 IL-17 A 的 mRNA 表達(dá)與 TCC-SUP 和 T24 細(xì)胞中 ERα 的表達(dá)變化一致，這與報道的 PTEN/pAKT 途徑對 IL-17 A 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相符（圖 6I）。此外，KEGG 通路分析顯示，在 BLCA 細(xì)胞中，ERα 可通過外泌體調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中的 PTEN/pAKT 通路來促進(jìn) M2 型極化和 IL-17 A 的產(chǎn)生（圖 5C）。綜上所述，圖 6A-I 的結(jié)果表明，BLCA 細(xì)胞中的 ERα 可通過外泌體調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中的 PTEN/pAKT 通路，從而調(diào)控巨噬細(xì)胞的 M2 極化和 IL-17 A 的產(chǎn)生。

圖6.由ERα調(diào)控的腫瘤源性外泌體可通過PTEN/pAKT途徑促進(jìn)M2極化和IL-17 A的產(chǎn)生

7.ERα對pten/pakt通路下調(diào)機(jī)制的剖析：miR-642a-5p直接靶向PTEN mRNA的3'UTR區(qū)段

   我們觀察到，源自 BLCA 細(xì)胞的外泌體能夠通過調(diào)節(jié) PTEN/pAKT 信號通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向 M2 型極化以及 IL-17A 的生成。我們還發(fā)現(xiàn)，改變 BLCA 細(xì)胞中的 ERα 表達(dá)并不會改變巨噬細(xì)胞中 PTEN 的 mRNA 表達(dá)水平（圖 5D）。由于 PTEN 可能在轉(zhuǎn)錄后水平受到調(diào)控，我們重點關(guān)注了 miRNAs，因為它們通常存在于外泌體中，并在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮著作用。通過生物信息學(xué)分析，我們篩選出了八種在 BLCA 中參與 PTEN 調(diào)控的候選 miRNAs（圖 7A），并通過調(diào)節(jié) BLCA 細(xì)胞中的 ERα 表達(dá)來評估它們的表達(dá)情況，隨后我們確定了 miR-642a-5p 和 miR-5754-3p 為有潛力的候選分子（圖 7B）。為了驗證這些候選分子的功能，我們將 T24 細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，同時用針對 miR-642a-5p 和 miR-5754-3p 的基于載體的抑制劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。隨后，我們評估了巨噬細(xì)胞中 PTEN/pAKT 的表達(dá)情況。有趣的是，與轉(zhuǎn)染了 miR-642a-5p 抑制劑的 T24 細(xì)胞共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞，其 PTEN/pAKT 信號軸發(fā)生了顯著變化，與與 T24-pLKO 細(xì)胞共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞相比（圖 7C）。此外，在 BLCA 細(xì)胞中抑制 miR-642a-5p 能夠有效逆轉(zhuǎn) ERα 對巨噬細(xì)胞中 PTEN/pAKT 的影響（圖 7D）。

   基于上述研究結(jié)果，我們進(jìn)行了熒光素酶報告基因檢測，以進(jìn)一步證實 miR-642a-5p 在轉(zhuǎn)錄后階段通過與 PTEN 的 3'UTR 結(jié)合而下調(diào)其表達(dá)。首先，我們使用 starBase v2.0在 PTEN 的 3'UTR 中確定了潛在的 miR-642a-5p 靶向位點。隨后，我們利用 psiCHECK2 載體構(gòu)建了野生型（WT）和突變型（Mut）的 3'UTR 版本，后者缺少 miR-642a-5p 的靶向位點（圖 7E）。熒光素酶檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了野生型 PTEN 3'UTR 的 THP-1 細(xì)胞在加入 miR-642-5p 抑制劑后熒光素酶活性顯著增加，而在過表達(dá) miR-642-5p 時則降低。相反，轉(zhuǎn)染突變型 PTEN 3'UTR 的 THP-1 細(xì)胞中的熒光素酶活性基本保持不變（圖 7F）。

   鑒于 BLCA 細(xì)胞中 miR-642a-5p 的表達(dá)受 ERα 影響（圖 7B），我們進(jìn)行了 CHIP 檢測，以探究 ERα 是否能通過與 miR-642a-5p 的啟動子結(jié)合來轉(zhuǎn)錄調(diào)控其表達(dá)。我們還研究了位于 miR-642a-5p 啟動子區(qū)域內(nèi)的三個預(yù)測的雌激素反應(yīng)元件（ERE），這些元件可能與 ERα 結(jié)合。結(jié)果表明，ERE1 可能是最有前景的候選者（圖 6A-B）。隨后，我們進(jìn)行了熒光素酶報告基因檢測，使用含有野生型（WT）或突變型（Mut）ERE1 的 pGL3 報告質(zhì)粒來驗證 ERE1 的功能（圖 6C）。熒光素酶檢測結(jié)果表明，在 ERα 過表達(dá)組中，野生型報告基因轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著增加，而在 ERα 去除組中則急劇下降。相比之下，突變組未觀察到變化（圖 6D）。

圖7.ERα調(diào)節(jié)的 miR-642a-5p 通過靶向PTEN mRNA 的3'UTR 作用，下調(diào)了 PTEN/pAKT 通路

8.臨床前小鼠模型研究證實，靶向ERα通過阻礙M2巨噬細(xì)胞極化和VM形成來抑制腫瘤進(jìn)展

   為驗證上述發(fā)現(xiàn)，我們構(gòu)建了一個體內(nèi)異種移植小鼠模型。將TCC-SUP 細(xì)胞和 THP-1 細(xì)胞一起皮下注射到小鼠的兩側(cè)背部，并對腫瘤荷瘤小鼠每隔3 天通過尾靜脈給予來自共同培養(yǎng)的 TCC-SUP 細(xì)胞的外泌體或PBS（作為對照）進(jìn)行治療，持續(xù)兩周。為了針對上述小鼠模型中的ERα 進(jìn)行靶向治療，每隔一天通過腹腔注射其拮抗劑ICI-182，780 或DMSO，持續(xù) 4 周，直至小鼠達(dá)到治療終點（圖8A）。根據(jù)不同的治療方式，將小鼠分為四組：PBS + DMSO 組、PBS + ICI-182，780組、外泌體 + DMSO 組和外泌體+ ICI-182，780組（每組 6 只）。各組的腫瘤生長率和腫瘤生長曲線顯示，來自共同培養(yǎng)的BLCA 細(xì)胞的外泌體顯著促進(jìn)了腫瘤生長，而通過 ICI-182，780抑制 ERα 可以減少腫瘤生長（圖8B、C）。免疫組化染色分析的結(jié)果證實，腫瘤細(xì)胞衍生的外泌體通過上調(diào)CDH-5 表達(dá)促進(jìn)了 VM 的形成，并促進(jìn)了TAMs 的 M2 型極化。此外，通過添加ICI-182,780 來抑制ERα，顯著減少了由 BLCA 小鼠模型（使用TCC-SUP 和 THP-1 系統(tǒng)構(gòu)建）中CDH5 控制的VM形成以及M2 型極化現(xiàn)象（圖 8D、E）。

   為進(jìn)一步驗證miR-642a-5p 在體內(nèi)的作用是否與我們在體外的研究結(jié)果相符，我們進(jìn)行了另一項異種移植動物實驗。在該實驗中，我們將三種不同的組合分別注射到小鼠的側(cè)腹壁：單獨的TCC-SUP 細(xì)胞、轉(zhuǎn)染了 pLKO 載體的TCC-SUP 細(xì)胞與 THP-1 細(xì)胞的組合，以及轉(zhuǎn)染了pLKO-miR-642a-5p 抑制劑的TCC-SUP 細(xì)胞與 THP-1 細(xì)胞的組合。六周后，我們觀察到，與TCC-SUP 細(xì)胞或TCC-SUP-pLKO-miR-642a-5p 抑制劑+ THP-1 細(xì)胞所產(chǎn)生的腫瘤相比，TCC-SUP-pLKO + THP1 細(xì)胞的聯(lián)合注射導(dǎo)致腫瘤明顯更大。重要的是，與其他兩組相比，TCC-SUP-pLKO-miR-642a-5p抑制劑 + THP-1 細(xì)胞的聯(lián)合注射顯著抑制了腫瘤生長（圖8F）。此外，免疫組化染色顯示，miR-642a-5p 的抑制減少了巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的IL-17A 表達(dá)和 M2 極化，從而減少了體內(nèi)ERα 調(diào)控的VM的形成（圖8G-H）。

   綜上所述，這些結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞通過誘導(dǎo)BLCA 中 ERα 表達(dá)的上調(diào)來促進(jìn)腫瘤生長和VM的形成。相反，ERα?xí)龠M(jìn)巨噬細(xì)胞向 M2 型極化，并通過上調(diào)miR-642a-5p（該miRNA 由 BLCA 細(xì)胞的外泌體轉(zhuǎn)運）來增加巨噬細(xì)胞中IL-17A 的表達(dá)。此外，本研究還表明，在 BLCA 微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞與癌細(xì)胞之間存在一個由ERα 介導(dǎo)的反饋回路，這顯著促進(jìn)了 BLCA 的進(jìn)展（圖9）。

圖8.在體內(nèi)，靶向ERα通過抑制M2巨噬細(xì)胞極化和VM形成來抑制腫瘤進(jìn)展

圖9.BLCA微環(huán)境中巨噬細(xì)胞與癌細(xì)胞之間的反饋回路示意圖

結(jié)論

   總之，巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的 BLCA 中的 ERα 通過轉(zhuǎn)錄上調(diào) CDH5 來促進(jìn)血管生成瘤的形成。ERα 表達(dá)的增加隨后通過腫瘤來源的外泌體所攜帶的 miR-642a-3p 促進(jìn) M2 型極化。因此，針對這一新發(fā)現(xiàn)的信號通路的治療策略可能對 BLCA 患者的治療具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

Liu Q, Wang J, Gao S, Li Z, Zhang W, Liu W, Liu B, Dong G, You B. ERα-dependent crosstalk between macrophages and cancer cells potentiates vasculogenic mimicry and M2 macrophage polarization in bladder cancer. Cell Commun Signal. 2025 Jul 15;23(1):339. doi: 10.1186/s12964-025-02297-7. PMID: 40665298; PMCID: PMC12261844.